Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分析

Ⅰ型禽腺病毒在我国鸡群中的流行情况和防控措施作者：李敏，马玉峰，杨振来源：《兽医导刊》 2017年第1期李敏马玉峰/ 金宇保灵生物药品有限公司杨振/ 扬州优邦生物药品有限公司腺病毒是全世界家禽和野禽常见的传染病原。

许多腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但有一些因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原。

根据血清学关系，禽腺病毒可以分为12 个血清型 (FAdV 1-12)。

而国际病毒分类委员会（ICTV）将禽腺病毒的12 个血清型分为5 个亚群(FAdVA-E)。

I 群禽腺病毒在中国鸡群中发病率非常之高，且呈逐年上升趋势, 且在水禽中也有发病的报道。

主要造成鸡群的包涵体肝炎和心包积液两种临床类型，给养鸡企业造成较大的经济损失。

笔者通过对流行地区腺病毒的跟踪监测和对病毒的分离鉴定，以了解I 型禽腺病毒在我国的流行特点和现状，同时对该病的防控提供一定的措施。

一、I 群禽腺病毒的流行特点根据笔者统计，目前在全国多个地区均有该病毒的发生（表1），该病可感染1 ～ 6 周龄任何品种鸡。

发病日病程短的4 ～ 8 d 逐渐恢复，一般7 ～ 10 d，也可以持续2 ～ 3 周甚至更长的时间。

发病鸡群死亡高峰多持续期4 ～ 8 d，病程8 ～ 15 d，死亡率10% ～ 60%不等。

禽腺病毒可引起包括包涵体肝炎 (IBH) 、安卡拉病/ 肝炎和心包积液综合征 (HHS) 、以及肌胃糜烂或溃疡(GEU)。

目前我们检测发现两种常见症状：包涵体肝炎(IBH) 和安卡拉病/ 肝炎和心包积液综合征 (HHS)。

鸡心包积液肝炎综合征病可以感染2 ～ 7 周龄鸡（白羽、黄羽、蛋鸡、817 肉鸡）。

蛋鸡从30 日龄起至产蛋高峰期均可发病。

该病2014 开始在我国多地区呈普发态势，已经成为一种严重危害养禽业发展的传染病。

致病病原已经确定为Ⅰ群4 血清型腺病毒（基因型C）。

病鸡出现精神沉郁，食欲减退或废绝，翅膀下垂，羽毛蓬乱，曲腿蹲立、伏卧不起，鸡冠和肉髯发白症状，临死前鸣叫、扑腾、挣扎，并出现角弓反张等神经症状。

造成鸡产蛋下降综合征原因和预防徐五一(安徽宁国市畜牧兽医局242300)摘要：鸡产蛋下降综合征是一种病毒急性病，主要会让母鸡和商品鸡的产蛋率大幅度下降，又被俗称为鸡减蛋综合征。

鸡产蛋下降综合征可以使母鸡和商品蛋鸡的产蛋率至少下降10%袁严重情况会下降30%袁并且生产出的鸡蛋也会出现40%左右的破损率，严重影响蛋鸡的产量，直接影响养殖户的经济收入，被列为国家二类动物疫病。

本文将对鸡产蛋下降综合征的原因和预防方法进行详细分析，使养殖户得到更深入的理解。

关键词院鸡产蛋下降综合征；原因；预防方法々禽业技术丨疫病防治1病原学鸡产蛋下降综合征是一种禽腺病毒引起的，直接引起鸡、鸽、鸭子、鹅等禽类的产蛋率下降，对猪、牛、羊、兔子等动物没有影响。

禽腺病毒目前只发现这一个血清型，有双链D N A结构，没有囊膜，是一种二十面对称体，直接约为80纳米。

禽腺病毒的主要致病原因为该病毒会与禽类红细胞结合、凝结，从而影响产蛋率。

禽腺病毒可以长时间存活，在4益的温度下，存活时间尤为突出，超过70益会被杀死。

禽腺病毒能适应大多数p H，对氯仿、乙醚等部分杀毒液不敏感[1]。

杀灭禽腺病毒可以使用福尔马林试剂的0.3%溶液，48h后完全灭火杀菌。

禽腺病毒的主要宿主为鸡和鸭，主要易感动物是鸡，并且在生产上对鸡蛋的影响最大。

鸡产蛋下降综合征对各年龄段的鸡都存在感染性，但雏鸡感染后无任何症状且无抗体，直到产蛋期后血清检验才转化为阳性，故而影响检测效率。

2流行病学鸡产蛋下降综合征的主要传播方式是蛋垂直传播，但也有部分通过呼吸道传播。

鸡产蛋下降综合征是所有年龄段的鸡都可能感染的，但雏鸡没有任何临床症状，只有在母鸡产蛋高峰期内，病毒被活化，明显影响产蛋量和鸡蛋破损率。

携带病菌的鸡会在产蛋高峰期内将病毒排出，并迅速在鸡群间互相传播。

其中平养鸡群传播速度极快，严重影响生产数量；而笼养鸡的传播速度就缓慢许多，传播至整个鸡群至少需要3个月时间。

3临床症状患病鸡在雏鸡阶段没有任何明显症状，但在产蛋高峰期产蛋率会下降、产蛋的破损率也会升高。

88鹅痛风型星状病毒感染的诊断与防治研究进展

2021 年 第

8 期

鹅痛风型星状病毒感染的诊断与防治研究进展

邓丽二刘保国二杭柏林5(1.

河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003 ； 2.

扬州大学兽医学院，

教育部禽类预防医学重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州

225009 )

摘 要：鹅痛风型星状病毒感染是1种新的病毒性传染病，对我国的养鹅业产生严重危害。文章介绍鹅痛风

型星状病毒的相关生物学特性，综述鹅痛风型星状病毒感染的诊断和防治的研究进展，提出一些问题和建议，

以

期为鹅痛风型星状病毒感染的防控和科学研究提供参考。

关键词：鹅痛风型星状病毒；诊断；防治；疫苗

中图分类号：S 855.3 文献标识码：A 文章编号：1672-9692(2021)08-0088-06

Research progress

in

diagnosis and

prevention of

infection

with geese astrovirus associated gout

Deng Li1, Liu Baoguo1, Hang Bolin1,2

*

(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Institute of Science and Technology,

Henan Xinxiang 453003; 2. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Key Laboratory ofJiangsu Preventive Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009)

Abstract: Infection with geese astrovirus associated gout is a new viral infectious disease, which has caused serious harm to goose breeding industry in China. In

一例由疫苗接种引起的商品肉鸡多病原混合感染作者：盛晓丹郭卉秦春芝刘霞黄迪海徐怀英秦桌明来源：《家禽科学》2021年第11期摘要：为确诊山东某商品肉鸡群发病的原因，采集病死鸡的喉头、气管等组织，分别进行核酸和病原分离鉴定。

结果显示，传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和禽腺病毒4型（FAdV-4）等特异性PCR均呈阳性，而新城疫病毒（NDV）、低致病性禽流感H9N2等均为阴性。

测序结果表明，ILTV分离株（PY）与疫苗株（K317）ICP4基因的核苷酸同源性为100%;而IBV分离株（PY）与疫苗株H120、4/91N基因的同源性分別为86.4%、86.6%，显示出较大的差异。

CAM途径接种鸡胚分离出腺病毒，且对SPF鸡胚具有一定的致病性。

同时，从病鸡肝脏中分离到大肠杆菌，药敏试验证实对多粘菌素B、健牧茶多酚、阿莫西林棒酸、头孢噻肟敏感，采用敏感药物治疗后取得一定的临床治疗效果。

综上所述，该病是一起由疫苗接种应激而引起的多病原混合感染。

关键词：传染性喉气管炎病毒;禽腺病毒4型;传染性支气管炎病毒;大肠杆菌;混合感染中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2021）11-0039-062021年4月于山东某商品肉鸡场发现一起严重呼吸道症状的病例。

该场肉鸡于7日龄免疫新支二联活疫苗（La Sota株+H120株），19日龄采用点眼方式接种传染性喉气管炎活疫苗（K317株），免疫2 d后出现呼噜声、咳嗽，严重者有引颈呼吸等呼吸困难的症状，并迅速波及全群，死淘率逐日攀升，多种药物治疗效果不佳。

临床剖检发现喉头、气管粘膜出血严重，气管内有大量的红色粘液，细支气管内有黄色栓塞物，个别鸡出现心包炎、气囊炎、心包积液增多的症状，疑似病毒和细菌混合感染。

笔者采集死亡鸡只的气管、肺、喉头、肝脏等组织样品进行病毒的PCR鉴定及细菌分离与药敏试验，确认肉鸡发病及死亡原因，为此次病情的预防控制和科学用药提供参考。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):４５３￣４６０ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ曹影丽ꎬ刘㊀琪ꎬ柴震震ꎬ等.鸡ｃＧＡＳ基因的克隆㊁表达特性分析及ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):４５３￣４６０.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.０１８鸡ｃＧＡＳ基因的克隆㊁表达特性分析及ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化曹影丽ꎬ㊀刘㊀琪ꎬ㊀柴震震ꎬ㊀杨侃侃ꎬ㊀梁月巧ꎬ㊀宋祥军ꎬ㊀邵㊀颖ꎬ㊀涂㊀健ꎬ㊀祁克宗(兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室/安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室ꎬ安徽合肥２３００３６)收稿日期:２０２２￣０５￣２３基金项目:国家自然科学基金项目(３１９７２６４２)作者简介:曹影丽(１９９７－)ꎬ女ꎬ河南周口人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事兽医病理学研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１１０７８０１２６５＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:祁克宗ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｑｋｚ＠ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀ｃＧＡＳ作为一种新型的胞质ＤＮＡ受体ꎬ在宿主抵抗ＤＮＡ病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用ꎮ血清４型禽腺病毒(Ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４ꎬＦＡｄＶ￣４)是无囊膜的一种双链ＤＮＡ病毒ꎬ可引起鸡肝炎￣心包积液综合征ꎮ为明确鸡ｃＧＡＳ(ｃｈｃＧＡＳ)基因功能ꎬ探究在鸡肝癌(ＬＭＨ)细胞中过表达ｃｈｃＧＡＳ以及ＦＡｄＶ￣４感染前后细胞定位的变化情况ꎮ本研究针对ｃｈｃＧＡＳ序列设计引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域ꎬ构建重组质粒ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ进行原核表达ꎬ通过ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎬ利用激光共聚焦观察ＦＡｄＶ￣４感染ＬＭＨ细胞前后ｃｈｃＧＡＳ细胞定位变化ꎮ结果表明ꎬ本试验克隆得到大小为１３１７ｂｐ的ｃｈｃＧＡＳ基因ꎬ与其他物种同源性为５０.５％~８４ ４％ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析结果显示ꎬｃｈｃＧＡＳ蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达ꎬ目的蛋白质相对分子质量为７５０００ꎬ与预期大小相符ꎮ亚细胞定位结果显示ꎬＦＡｄＶ￣４感染可导致定位于细胞核膜上的ｃｈｃＧＡＳ蛋白转移到细胞质中ꎮ本研究结果为进一步研究ＦＡｄＶ￣４与ｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧ信号通路的关联调控机制提供了科学依据ꎮ关键词:㊀ｃＧＡＳꎻ血清４型禽腺病毒(ＦＡｄＶ￣４)ꎻ序列分析ꎻ原核表达ꎻ亚细胞定位中图分类号:㊀Ｓ８３１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０４５３￣０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎｃＧＡＳｇｅｎｅａｎｄｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＦＡｄＶ￣４ｉｎｆｅｃｔｉｏｎＣＡＯＹｉｎｇ￣ｌｉꎬ㊀ＬＩＵＱｉꎬ㊀ＣＨＡＩＺｈｅｎ￣ｚｈｅｎꎬ㊀ＹＡＮＧＫａｎ￣ｋａｎꎬ㊀ＬＩＡＮＧＹｕｅ￣ｑｉａｏꎬ㊀ＳＯＮＧＸｉａｎｇ￣ｊｕｎꎬ㊀ＳＨＡＯＹｉｎｇꎬ㊀ＴＵＪｉａｎꎬ㊀ＱＩＫｅ￣ｚｏｎｇ(ＡｎｈｕｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ/ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅＡｎｉｍａｌＦｏｏｄＱｕａｌｉｔｙａｎｄＢｉｏｓａｆｅｔｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ｃＧＡＳｐｌａｙｓａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｈｏｓｔ ｓｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅａｇａｉｎｓｔＤＮＡｖｉｒｕｓｅｓａｓａｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.Ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４(ＦＡｄＶ￣４)ｉｓａｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｖｉｒｕｓｗｉｔｈｏｕｔａｎｅｎｖｅ￣ｌｏｐｅꎬａｎｄｃａｎｃａｕｓｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ￣ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｅｆｆｕｓｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｃｈｉｃｋｅｎ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｃｋｅｎｃＧＡＳ(ｃｈｃＧＡＳ)ｇｅｎｅꎬｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｃＧＡＳｉｎｃｈｉｃｋｅｎｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ(ＬＭＨ)ｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｅｌｌｌｏｃａｔｉｏｎｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＦＡｄＶ￣４ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｈｃＧＡＳｓｅｑｕｅｎｃｅꎬａｎｄｔｈｅｃｈｃＧＡＳｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ.Ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｏｔｈｅｒｓｐｅ￣ｃｉｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｏｍａｉｎｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄ.Ｔｈｅｒｅ￣３５４ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｏｒｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＳＤＳ￣ＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔꎬａｎｄｔｈｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｈｃＧＡＳｉｎＬＭＨｃｅｌｌｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＦＡｄＶ￣４ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｍｉ￣ｃｒｏｓｃｏｐｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈｃＧＡＳｇｅｎｅｗｉｔｈａｓｉｚｅｏｆ１３１７ｂｐｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｗａｓ５０ ５％－８４ ４％.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＳＤＳ￣ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｃｈｃＧＡＳｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｉｎｔｈｅｆｏｒｍｏｆｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ７５０００ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎ￣ｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｓｉｚｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＦＡｄＶ￣４ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｏｕｌｄｌｅａｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｃｈｃＧＡＳｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｏｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｅｔｗｅｅｎＦＡｄＶ￣４ａｎｄｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃＧＡＳꎻｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４(ＦＡｄＶ￣４)ꎻｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓꎻｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀当外界的病原微生物或其产物进入机体时ꎬ细胞内的模式识别受体(ＰＲＲｓ)活化ꎬ进而产生Ｉ型干扰素(ＩＦＮ)和一些促炎细胞因子[１￣３]ꎮ在过去的几年里ꎬ模式识别受体研究领域将胞质ＤＮＡ感受器作为重要研究方向[４￣６]ꎮＰＲＲｓ是一类天然免疫分子ꎬ是天然免疫受体识别的重要组成部分[７￣８]ꎮ２０１３年Ｗｕ等[９]发现细胞中存在某种物质可以通过识别胞质内的ＤＮＡ激活ＩＦＮ￣β信号通路ꎬ质谱检测分析后发现是一种新的物质ꎬ这种物质为环磷酸鸟苷￣腺苷(ｃＧＡＭＰ)ꎬ并且该物质可以通过与干扰素刺激基因(ＳＴＩＮＧ)结合从而激活ＩＦＮ信号通路ꎮ也有研究结果表明ꎬｃＧＡＳ可以作为一种广谱胞质ＤＮＡ受体识别胞质内ＤＮＡ并激活ＩＦＮ信号通路[１０]ꎮ常规情况下ꎬ细胞质内存在的ＤＮＡ较少ꎬ故以ｃＧＡＳ为主的胞质ＤＮＡ感受器处于未活化的状态ꎮ但当细胞处于某些应激状态时ꎬ比如ＤＮＡ病毒感染ꎬ其胞质内的ＤＮＡ含量上升ꎬ随后可通过ｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧ通路发挥抗病毒作用ꎮ目前ꎬ普遍认为ｃＧＡＳ定位于细胞质中ꎬ而Ｂａｒｎｅｔｔ等[１１]指出ꎬｃＧＡＳ并非传统意义上的胞质蛋白质ꎬ而是通过其Ｎ端磷酸肌醇结合域的作用从而出现膜定位的一种蛋白质ꎬ并提到在静息状态下ꎬｃＧＡＳ定位在细胞膜ꎬ而识别ＤＮＡ病毒感染后可出现由细胞膜到细胞质转位的现象ꎮ目前ꎬ关于鸟类中ｃＧＡＳ的研究也有报道ꎮ杨洁[１２]的研究结果表明ꎬｃＧＡＳ和ＳＴＩＮＧ信号轴对ＤＮＡ病毒㊁ＲＮＡ病毒和反转录病毒均有抗病毒作用ꎬ证明其广泛的抗病毒功能和在鸡先天免疫中的关键作用ꎮＯｌｉｖｅｉｒａ等[１３]的研究结果表明ꎬ在鸡巨噬细胞中ꎬｃＧＡＳ/ＳＴＩＮＧ通路不但能产生Ｉ型干扰素以响应细胞内ＤＮＡ刺激ꎬ而且对调节巨噬细胞效应器功能[包括组织相容性复合体(ＭＨＣ￣ＩＩ)和共刺激分子的表达]至关重要ꎮ在禽痘病毒(一种禽ＤＮＡ病毒)感染的情况下ꎬ发现ｃＧＡＳ/ＳＴＩＮＧ途径与Ｉ型干扰素的产生及ＭＨＣ￣ＩＩ转录有关ꎮ禽腺病毒４型属于腺病毒科禽腺病毒属ꎬ是无囊膜的双链ＤＮＡ病毒ꎮ血清４型禽腺病毒(ＦＡｄＶ￣４)是肝炎￣心包积液综合征的主要病原体ꎮ作为一种ＤＮＡ病毒ꎬ目前Ｗａｎｇ等[１４]通过在鸡胚成纤维细胞(ＣＥＦ)中瞬时转染鸡ｃＧＡＳ基因(ｃｈｃ￣ＧＡＳ)来研究其亚细胞定位ꎬ结果表明ꎬｃｈｃＧＡＳ主要定位在细胞质中ꎮ通过过表达ｃｈｃＧＡＳ基因和ＲＮＡ干扰ｃｈｃＧＡＳ基因ꎬ证明了ｃｈｃＧＡＳ对外源性双链ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)以及来自ＤＮＡ损伤反应的自身ｄｓＤＮＡ有反应ꎬ从而激活了ＳＴＩＮＧ/ＴＢＫ１/ＩＲＦ７介导的先天免疫ꎮ目前ꎬ对于ｃｈｃＧＡＳ的研究着重在其作为胞质ＤＮＡ感受器触发一系列通路方面的探索ꎬ但关于鸡ｃＧＡＳ在体外的蛋白质表达以及鸡ｃＧＡＳ在ＤＮＡ病毒感染后细胞内定位㊁转位的研究较少ꎮｃＧＡＳ对胞质内ＤＮＡ的识别是非特异性的ꎬ几乎可以识别所有的双链ＤＮＡ[１５￣１６]ꎮ本研究拟通过克隆ｃｈｃＧＡＳ的完整开放阅读框序列ꎬ构建原核表达载体ꎬ获得ｃｈｃＧＡＳ蛋白ꎬ此外ꎬ通过对比ｃｈｃＧＡＳ被ＦＡｄＶ￣４感染前后细胞定位的变化更进一步阐述ｃｈｃＧＡＳ在触发天然免疫激活中的作用ꎬ以期为进一步研究ＦＡｄＶ￣４与ｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧ信号通路的关联调控机制提供科学依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞和毒株鸡肝癌(ＬＭＨ)细胞由中国农业科学院上海兽医研究所刘光清研究员赠送ꎮＦＡｄＶ￣４ＡＨ￣Ｆ１９株[１７](登录号:ＭＮ７８１６６６)由本实验室分离并经过４５４江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期鉴定后保存于－８０ħ冰箱ꎮ１.２㊀菌株和质粒感受态细胞ＤＨ５α㊁Ｒｏｓｓｅｔａ(ＤＥ３)购于南京擎科生物科技有限公司ꎮｐＥＴ￣３２ａ㊁ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ㊁ｐｍＣｈｅｒ￣ｒｙ￣Ｃ１质粒由本实验室保存于－２０ħ冰箱ꎮ１.３㊀主要试剂ＳａｎＰｒｅｐ柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒㊁ＥＣＬ发光显色工作液㊁质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司ꎬ２ˑＨｉｆｆＣａｎａｃｅ ＧｏｌｄＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自上海翌圣生物科技有限公司ꎬ去内毒素质粒提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司ꎬＰＡＧＥ蛋白凝胶快速配制试剂盒㊁５ˑ蛋白质上样缓冲液㊁雅酶三色预染Ｍａｒｋ￣ｅｒ购自上海雅酶生物医药科技有限公司ꎬＥｃｏＲＩ限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司ꎮ同源重组连接酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司ꎬ鼠抗ＨＡ单克隆抗体㊁鼠抗Ｈｉｓ单克隆抗体购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司ꎬＦＩＴＣ标记二抗羊抗鼠㊁山羊抗鼠ＩｇＧ￣ＨＲＰ购自武汉博士德生物工程有限公司ꎮ１.４㊀序列分析与结构域预测从ＮＣＢＩ中下载已发表的一些物种的ｃＧＡＳ序列ꎬ通过Ｍｅｇａｌｉｇｎ软件进行同源性分析并利用ＭＥＧＡ５.０对各物种序列构建遗传进化树ꎮ用ＳＭＡＲＴ在线网站(ｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/)预测ｃｈｃＧＡＳ的结构域ꎮ１.５㊀引物设计与基因扩增根据ＧｅｎＢａｎｋ中发表的ｃｈｃＧＡＳ基因序列ꎬ使用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５软件设计基因扩增的上下游引物ꎬ引物合成序列见表１ꎮ按照ＲＮＡ提取试剂盒说明书提取ＬＭＨ细胞中的总ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡꎬ以此为模板扩增ｃｈｃＧＡＳ特异性引物ꎮ１.６㊀重组质粒ｃｈｃＧＡＳ载体的构建根据ｃｈｃＧＡＳ基因序列ꎬ利用ＣＥＤｅｓｉｇｎＶ１.０４软件依次设计ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐｍ￣Ｃｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ同源臂引物ꎬ引物合成序列见表１ꎮ表１㊀本研究所用引物对序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ｃｈｃＧＡＳ￣ＦＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧｃｈｃＧＡＳ￣ＲＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡＴｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＦＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＲＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＦＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＲＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＦＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ￣ＲＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡ加粗的字母为同源臂序列ꎮ㊀㊀ＰＣＲ反应体系(５０μｌ):２ˑＨｉｆｆＣａｎａｃｅ ＧｏｌｄＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μｌ㊁ｄｄＨ２Ｏ１９μｌ㊁ＤＮＡ模板２μｌ㊁上下游引物各２μｌꎮＰＣＲ反应条件:９８ħ预变性３ｍｉｎꎻ９８ħ变性１０ｓꎬ５８ħ退火２０ｓꎬ７２ħ延伸３ｍｉｎꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ再延伸５ｍｉｎꎮ利用ＰＣＲ扩增含有酶切位点的ｃｈｃＧＡＳ基因ꎬＰＣＲ产物分别切胶回收ꎬ将其克隆到经ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＥＴ￣３２ａ㊁ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ㊁ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１空载体中ꎮ重组质粒经ＰＣＲ鉴定正确后移交到测序公司进行测序ꎮ重组质粒经鉴定后分别命名为ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳꎮ１.７㊀ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ诱导表达与可溶性分析将ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ与ｐＥＴ￣３２ａ空载体质粒分别转化Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)感受态细胞ꎬ涂布到氨苄抗性的固体培养板ꎬ次日分别挑取单菌落至溶菌肉汤(ＬＢ)液体培养基中ꎮ用摇床３７ħ㊁１８０ｒ/ｍｉｎ摇４~５ｈ后转接到大容积的ＬＢ液体培养基中ꎬ再次用摇床３７ħ㊁１８０ｒ/ｍｉｎ培养ꎬ当ＯＤ６００值为０.６~０ ８时ꎬ添加０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ的异丙基硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)于１５ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ诱导表达ꎬ取诱导２０ｈ后的菌体ꎬ用磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)进行洗菌ꎬ随后５５４曹影丽等:鸡ｃＧＡＳ基因的克隆㊁表达特性分析及ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化超声裂解至液体清亮ꎬ离心后分别吸取上清液和沉淀进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ而后经考马斯亮蓝染色㊁脱色后进行观察和分析ꎮ通过分析确定重组蛋白质表达可溶性ꎮ１.８㊀Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ检测将诱导后处理好的蛋白质样品ꎬ在ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯(ＰＶＤＦ)膜上ꎬ恒流１００ｍＡ转膜１ ０ｈꎮ将转膜后的ＰＶＤＦ膜放入配制好的５％脱脂奶粉封闭液中ꎬ随后移入４ħ冰箱过夜封闭ꎬ用磷酸缓冲液(ＰＢＳＴ)洗涤２~３次ꎬ按照１ʒ５０００(体积比)加入鼠抗Ｈｉｓ单克隆抗体作为一抗ꎬ常温下孵育１.５ｈꎬ在用ＰＢＳＴ洗涤２~３次ꎬ同样按照１ʒ５０００(体积比)加入山羊抗鼠ｌｇＧ￣ＨＲＰ作为二抗ꎬ常温孵育１ ０ｈꎬ用ＰＢＳＴ洗涤２~３次ꎬ随后用辣根过氧化物酶化学发光剂(ＨＲＰ￣ＥＣＬ)底物发光显色工作液进行显色ꎮ１.９㊀ｃｈｃＧＡＳ感染前后亚细胞定位为了观察ｃｈｃＧＡＳ在ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化ꎬ设置２组试验ꎬ分为感染组和对照组(未感染)ꎬ分别将２组长满的ＬＭＨ细胞接种于铺上细胞爬片的１２孔板中ꎬ观察细胞ꎬ细胞密度达到８０％左右将ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒转染进细胞ꎬ对照组２４ｈ后弃培养液ꎬ换成新鲜的维持培养液ꎬ感染组在质粒转染２４ｈ后接种ＦＡｄＶ￣４ＡＨ￣Ｆ１９株ꎬ３７ħ培养１ｈꎬ弃去培养液ꎬ用ＰＢＳ清洗细胞２次ꎬ感染８ｈ后分别收取感染组和对照组样品ꎬ通过间接免疫荧光步骤ꎬ分别使用ＨＡ标签鼠抗多克隆抗体作为一抗ꎬＦＩＴＣ绿色荧光抗体作为二抗ꎬ而后利用激光共聚焦观察分析ｃｈｃＧＡＳ在ＬＭＨ细胞中的定位情况ꎮ为了进一步证实ｃｈｃＧＡＳ的定位ꎬ同样将ｐｍ￣Ｃｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒转染到ＬＭＨ细胞ꎬ以相同的方法对转染后的细胞进行收样ꎬ利用ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１载体自带红色荧光在激光共聚焦显微镜下观察ｃｈｃＧＡＳ定位情况ꎬ观察是否与ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒定位情况一致ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀序列分析与结构域预测通过Ｍｅｇａｌｉｇｎ比对分析物种间ｃＧＡＳ核苷酸同源性ꎬ结果显示ꎬｃｈｃＧＡＳ与其他物种ｃＧＡＳ的同源性为５０.５％~８４ ４％(图１)ꎮ将ｃｈｃＧＡＳ与其他物种ｃＧＡＳ核苷酸序列比对并对系统发育树进行分析ꎬ结果显示ꎬｃｈｃＧＡＳ与鸭子ｃＧＡＳ位于同一分支上ꎬ亲缘关系较近ꎻ但与鱼类ｃＧＡＳ和哺乳类ｃＧＡＳ不在同一分支上ꎬ表明亲缘关系稍远(图２)ꎮ利用ＳＭＡＲＴ在线网站预测ｃｈｃＧＡＳ的结构域ꎬ结果显示ꎬ编码区包括２个低复杂区域(Ｌｏｗ￣ＣｏｍｐｌｅｘｉｔｙｒｅｇｉｏｎꎬＬＣＲ)ꎬ分别为第３至第３９氨基酸与第６８至第８１氨基酸ꎬ还包括１个高度保守的Ｍａｂ￣２１结构域(第１２９至第４２９氨基酸)(图３)ꎮ１:鸡序列ꎻ２:牛序列ꎻ３:黑猩猩序列ꎻ４:鸭子序列ꎻ５:鱼序列ꎻ６:马序列ꎻ７:人类序列ꎻ８:猴子序列ꎻ９:老鼠序列ꎻ１０:猪序列ꎻ１１:兔子序列ꎮ图１㊀不同物种间ｃＧＡＳ核苷酸序列同源性分析Ｆｉｇ.１㊀ＨｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＧＡＳｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓｐｅｃｉｅｓ６５４江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期图２㊀不同物种ｃＧＡＳ基因核苷酸序列进化树分析Ｆｉｇ.２㊀ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＧＡＳｇｅｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓＬＣＲ:低复杂区域ꎮ图３㊀ｃｈｃＧＡＳ结构域预测Ｆｉｇ.３㊀ＤｏｍａｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｃｈｃＧＡＳ２.２㊀ｃｈｃＧＡＳ基因扩增结果经ＰＣＲ扩增ｃｈｃＧＡＳ基因得到目的条带(图４)ꎬ目的片段大小为约１３１７ｂｐꎬ显示与预期条带大小一致ꎬ经测序比对后与目的基因序列完全一致ꎮ２.３㊀重组质粒的酶切鉴定将ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ㊁ｐｍ￣Ｃｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒经ＥｃｏＲＩ酶切鉴定后在核酸凝胶电泳上显示的条带大小与预期的载体大小和目的基因大小一致(图５)ꎬ并且经测序比对分析后与目的基因序列完全一致ꎬ碱基未见缺失或者突变ꎬ说明重组质粒构建成功ꎮ２.４㊀ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ表达产物的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析㊀㊀将ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒转化到Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)感受态细胞中后ꎬ成功表达出相对分子质量为７５０００的目的蛋白质(图６)ꎬ分析结果显示ꎬ蛋白质在包涵体和上清液都有表达且主要集中在上清液表达ꎮ２.５㊀重组蛋白质的Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ鉴定利用Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ对蛋白质进一步鉴定分析ꎬ结果(图７)显示ꎬ在ＰＶＤＦ膜上有一条明显条带且位置大小与预期目的蛋白质大小一致ꎮ说明重组蛋白质可以被抗Ｈｉｓ标签的一抗识别ꎮＭ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１:ｃｈｃＧＡＳ基因ꎻ２:阴性对照ꎮ图４㊀ｃｈｃＧＡＳ基因扩增产物Ｆｉｇ.４㊀ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｃｈｃＧＡＳｇｅｎｅ２.６㊀ｃｈｃＧＡＳ感染前后亚细胞定位分析通过在ＬＭＨ细胞中转染ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ和ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃｌ￣ｃｈｃＧＡＳ来研究ｃｈｃＧＡＳ的细胞定位ꎮ结果显示ꎬ未感染ＦＡｄＶ￣４时ｃｈｃＧＡＳ主要分布在细胞核的核膜上ꎬ感染ＦＡｄＶ￣４后ꎬ可以观察到ｃｈｃＧＡＳ从细胞核的核膜向细胞质里转移(图８㊁图９)ꎮ７５４曹影丽等:鸡ｃＧＡＳ基因的克隆㊁表达特性分析及ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒酶切产物ꎻ２:ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒酶切产物ꎻ３:ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒酶切产物ꎮ图５㊀ｃｈｃＧＡＳ重组质粒酶切鉴定Ｆｉｇ.５㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｃＧＡＳｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ:蛋白质ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｐＥＴ￣３２ａ空载体未经ＩＰＴＧ诱导ꎻ２:ｐＥＴ￣３２ａ空载体经ＩＰＴＧ诱导ꎻ３:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒未经ＩＰＴＧ诱导ꎻ４:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒经ＩＰＴＧ诱导ꎻ５:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒诱导表达包涵体ꎻ６:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒诱导表达上清液ꎮ图６㊀ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ表达产物ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳Ｆｉｇ.６㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ１:ｐＥＴ￣３２ａ空载体经ＩＰＴＧ诱导表达ꎻ２:ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ重组质粒经ＩＰＴＧ诱导表达ꎮ图７㊀Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ鉴定ｃｈｃＧＡＳ蛋白的体外表达Ｆｉｇ.７㊀Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｃＧＡＳｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｉｔｒｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３㊀讨论ｃＧＡＳ作为近几年来发现的一种新型胞质ＤＮＡ受体ꎬ其功能为识别胞质内的ＤＮＡꎮ然而鸡ｃＧＡＳ基因的相关研究较少ꎬ通过Ｍｅｇａｌｉｇｎ比对分析物种间ｃＧＡＳ核苷酸同源性ꎬ结果显示ꎬｃｈｃＧＡＳ与其他物种ｃＧＡＳ的同源性为５０.５％~８４ ４％ꎬ且具有２个在第３至第３９氨基酸和第６８至第８１氨基酸的低复杂区域和１个高度保守的具有第１２９至第４２９氨基酸的Ｍａｂ￣２１结构域ꎬ表明ｃｈｃＧＡＳ与其他物种具有差异ꎮ本研究对ｃｈｃＧＡＳ基因进行了克隆ꎮ首先ꎬ通过构建ｐＥＴ￣３２ａ￣ｃｈｃＧＡＳ原核表达载体ꎬ其次ꎬ经过多种对比分析后从大肠杆菌表达菌株中挑选了Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)表达菌株ꎬ最后以１５ħ㊁异丙基硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁诱导２０ｈ为最适诱导条件ꎬ成功表达了ｃｈｃＧＡＳ蛋白ꎮＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析结果显示ꎬ重组蛋白质ｃｈｃＧＡＳ主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达ꎬ利用Ｈｉｓ标签抗体经Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ鉴定ꎬ在ＰＶＤＦ膜上显示有单一的条带且与预期目的蛋白质条带大小相符ꎮ在正常情况下ＤＮＡ只存在于细胞核和线粒体中ꎬ但在病毒感染后会游离在细胞质中ꎬ随后被位于细胞质中的ｃＧＡＳ识别ꎬ继而激活ｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧ通路发挥抗病毒作用[１０]ꎮ目前为止报道人和小鼠ｃＧＡＳ调控较多[１８]ꎬ以往的研究中ꎬ普遍认为人ｃＧＡＳ仅仅分布在细胞质中[１９]ꎬ并行使ＤＮＡ识别受体的功能[２０￣２１]ꎮ但近期有试验结果表明ꎬ人ｃＧＡＳ定位在细胞膜上ꎬ并指出有外源ＤＮＡ感染细胞时ｃＧＡＳ发生移位即可从细胞膜上转移到细胞质中从而识别一些ＤＮＡ而后激活天然免疫ꎮ鸡ｃＧＡＳ还没有得到足够的研究ꎬ尤其鸡ｃＧＡＳ的细胞定位㊁功８５４江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期能及精确调控机制还未完全研究清楚ꎮ先前Ｗａｎｇ等[１４]通过在鸡胚成纤维细胞中瞬时转染Ｆｌａｇ标记的ｃＧＡＳ来研究鸡ｃＧＡＳ的亚细胞定位ꎬ定位分析结果表明ꎬｃｈｃＧＡＳ分布在细胞质中ꎮ本研究使用ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ和ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ２个重组质粒在ＬＭＨ细胞中对ｃｈｃＧＡＳ进行定位ꎬ结果显示ꎬｃｈｃＧＡＳ是定位在细胞核的核膜上ꎬ此外还通过ＦＡｄＶ￣４感染ｃｈｃＧＡＳ对细胞定位进行观察ꎬ结果表明ꎬ在ＦＡｄＶ￣４感染后ｃｈｃＧＡＳ定位可从细胞核的核膜上转移到细胞质中ꎬ后续将通过构建稳定表达ｃｈｃＧＡＳ的ＬＭＨ细胞系对这一结果进行更加深入地研究验证ꎮ通过ｃｈｃＧＡＳ定位了解其在天然免疫中发挥的作用ꎬ同时也为后续研究ｃｈｃＧＡＳ的功能提供了理论依据ꎮＦＡｄＶ￣４:血清４型禽腺病毒ꎮＡ㊁Ｂ分别为ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ转染细胞在ＦＡｄＶ￣４感染前通过二氨基苯基吲哚(ＤＡＰＩ)染色荧光显微㊁ＦＩＴＣ绿色荧光抗体定位获得的定位图ꎻＣ为Ａ和Ｂ的叠加图ꎻＤ㊁Ｅ分别为ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ转染细胞在ＦＡｄＶ￣４感染８ｈ后通过二氨基苯基吲哚(ＤＡＰＩ)染色荧光显微㊁ＦＩＴＣ绿色荧光抗体定位获得的定位图ꎻＦ为Ｄ和Ｅ的叠加图ꎮ图８㊀ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳ表达产物ｃｈｃＧＡＳ亚细胞定位图Ｆｉｇ.８㊀ｐＣＡＧＧＳ￣ＨＡ￣ｃｈｃＧＡＳｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｍａｐＦＡｄＶ￣４:血清４型禽腺病毒ꎮＡ㊁Ｂ分别为ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ转染细胞在ＦＡｄＶ￣４感染前通过二氨基苯基吲哚(ＤＡＰＩ)染色荧光显微㊁编码蛋白质自带红色荧光定位法获得的定位图ꎻＣ为Ａ和Ｂ的叠加图ꎻＤ㊁Ｅ分别为ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ转染细胞在ＦＡｄＶ￣４感染８ｈ后通过二氨基苯基吲哚(ＤＡＰＩ)染色荧光显微㊁编码蛋白质自带红色荧光定位法获得的定位图ꎻＦ为Ｄ和Ｅ的叠加图ꎮ图９㊀ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳ表达产物ｃｈｃＧＡＳ亚细胞定位图Ｆｉｇ.９㊀ｐｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｃ１￣ｃｈｃＧＡＳｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｍａｐ９５４曹影丽等:鸡ｃＧＡＳ基因的克隆㊁表达特性分析及ＦＡｄＶ￣４感染前后亚细胞定位变化参考文献:[１]㊀ＴＡＫＥＵＣＨＩＯꎬＡＫＩＲＡＳ.Ｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｉｎ￣ｆｌａｍｍａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１０ꎬ１４０(６):８０５￣８２０. [２]㊀ＫＡＴＯＫꎬＩＳＨＩＩＲꎬＧＯＴＯＥꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａ￣ｌｙｓｅｓｏｆＤＮＡ￣ｓｅｎｓｉｎｇａｎｄｉｍｍｕｎｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｈｕｍａｎｃＧＡＳ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１３ꎬ８(１０):ｅ７６９８３.[３]㊀ＭＯＲＩＡꎬＯＬＥＳＺＹＣＫＡＥꎬＳＨＡＲＰＦＡꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｖａｃｃｉｎｅａｄｊｕ￣ｖａｎｔａｌｕｍｉｎｈｉｂｉｔｓＩＬ￣１２ｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇＰＩ３ｋｉｎａｓｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｗｈｉｌｅｃｈｉｔｏｓａｎｄｏｅｓｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔＩＬ￣１２ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓＴｈ１ａｎｄＴｈ１７ｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ４２(１０):２７０９￣２７１９.[４]㊀ＳＴＥＭＰＥＬＭꎬＣＨＡＮＢꎬＢＲＩＮＫＭＡＮＮＭＭ.Ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｐａｙｓｏｆｆ:ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓｈａｖｅｔｈｅｌｉｃｅｎｓｅｔｏｅｓｃａｐｅｔｈｅＤＮＡｓｅｎｓｉｎｇｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＭｅｄｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ２０８(３):４９５￣５１２.[５]㊀ＤＡＭＢＵＺＡＩＭꎬＢＲＯＷＮＧＤ.Ｃ￣ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎｓｉｎｉｍｍｕｎｉｔｙ:ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ３２:２１￣２７.[６]㊀ＳＴＥＩＮＳＣꎬＬＡＭＥꎬＦＡＬＣＫ￣ＰＥＤＥＲＳＥＮＥ.Ｃｅｌｌ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｇｕｌａ￣ｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｎｓｏｒｃａｓｃａｄｅｓ:ａｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ８６(２４):１３３０３￣１３３１２.[７]㊀ＺＨＯＵＨꎬＣＨＥＮＳꎬＷＡＮＧＭＳꎬｅｔａｌ.Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅ￣ｃｅｐｔｏｒｓｉｎｂｉｒｄｓ:ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａ￣ｎａｌｙｓｉｓꎬａｎｄｃｒｏｓｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１４ꎬ１５(１１):２１０４５￣２１０６８.[８]㊀ＫＥＡＴＩＮＧＳＥꎬＢＡＲＡＮＭꎬＢＯＷＩＥＡＧ.ＣｙｔｏｓｏｌｉｃＤＮＡｓｅｎｓｏｒｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｙｐｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ３２(１２):５７４￣５８１.[９]㊀ＷＵＪＸꎬＳＵＮＬＪꎬＣＨＥＮＸꎬｅｔａｌ.ＣｙｃｌｉｃＧＭＰ￣ＡＭＰｉｓａｎｅｎ￣ｄｏｇｅｎｏｕｓｓｅｃｏｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒｉｎｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｂｙＣｙ￣ｔｏｓｏｌｉｃＤＮＡ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３３９(６１２１):８２６￣８３０. [１０]ＳＵＮＬＪꎬＷＵＪＸꎬＤＵＦＨꎬｅｔａｌ.ＣｙｃｌｉｃＧＭＰ￣ＡＭＰｓｙｎｔｈａｓｅｉｓａｃｙｔｏｓｏｌｉｃＤＮＡｓｅｎｓｏｒｔｈａｔａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｔｙｐｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３３９(６１２１):７８６￣７９１.[１１]ＢＡＲＮＥＴＴＫＣꎬＣＯＲＯＮＡＳ￣ＳＥＲＮＡＪＭꎬＺＨＯＵＷꎬｅｔａｌ.Ｐｈｏｓ￣ｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎｃＧＡＳａｔｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｔｏｅｎｓｕｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｅｌｆ￣ａｎｄｖｉｒａｌＤＮＡ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１９ꎬ１７６(６):１４３２￣１４４６.[１２]杨㊀洁.鸡源天然免疫ＤＮＡ感受器ｃＧＡＳ￣ＳＴＩＮＧ信号轴功能及其抗病毒作用研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０２０.[１３]ＯＬＩＶＥＩＲＡＭꎬＲＯＤＲＩＧＵＥＳＤＲꎬＧＵＩＬＬＯＲＹＶꎬｅｔａｌ.ＣｈｉｃｋｅｎｃＧＡＳｓｅｎｓｅｓｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｓｍａｃｒｏｐｈａｇｅｅｆ￣ｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ１１.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｉｍｍｕ.２０２０.６１３０７９.[１４]ＷＡＮＧＪꎬＢＡＧꎬＨＡＮＹＱꎬｅｔａｌ.ＣｙｃｌｉｃＧＭＰ￣ＡＭＰｓｙｎｔｈａｓｅｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｃｙｔｏｓｏｌｉｃｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡａｎｄｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].Ｉｎ￣ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ１４６:４９７￣５０７.[１５]ＺＨＡＮＧＨＷꎬＪＩＮＷＪꎬＤＩＮＧＫꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐｏｕｌｔｒｙｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓꎬ２０１７ꎬ６１(３):３４１￣３４６.[１６]ＣＡＶＬＡＲＴꎬＤＥＩＭＬＩＮＧＴꎬＡＢＬＡＳＳＥＲＡꎬｅｔａｌ.Ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌｓｍａｌｌ￣ｍｏｌｅｃｕｌｅｃｏｍｐｏｕｎｄＣＭＡｂｙＳＴＩＮＧ[Ｊ].ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１３ꎬ３２(１０):１４４０￣１４５０. [１７]ＹＩＮＤＤꎬＸＵＥＭꎬＹＡＮＧＫＫꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｌａｙｉｎｇｆｌｏｃｋｗｉｔｈｈｙｄｒｏｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ￣ｈｅｐａｔｉｔｉｓｓｙｎ￣ｄｒｏｍｅ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ２０２０ꎬ１４７.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｍｉｃｐａｔｈ.２０２０.１０４３８１.[１８]ＤＡＩＪꎬＨＵＡＮＧＹＪꎬＨＥＸＨꎬｅｔａｌ.ＡｃｅｔｙｌａｔｉｏｎｂｌｏｃｋｓｃＧＡＳａｃ￣ｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓｓｅｌｆ￣ＤＮＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１９ꎬ１７６(６):１４４７￣１４６０.[１９]ＺＨＯＵＹꎬＨＥＣꎬＷＡＮＧＬꎬｅｔａｌ.Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｖｉｒａｌｉｎｎａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ４７(９):１４１４￣１４２６.[２０]ＣＩＶＲＩＬＦꎬＤＥＩＭＬＩＮＧＴꎬＤＥＯＬＩＶＥＩＲＡＭＡＮＮＣＣꎬｅｔａｌ.ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｙｔｏｓｏｌｉｃＤＮＡｓｅｎｓｉｎｇｂｙｃＧＡＳ[Ｊ].Ｎａ￣ｔｕｒｅꎬ２０１３ꎬ４９８(７４５４):３３２￣３３７.[２１]ＬＩＸＤꎬＷＵＪＸꎬＧＡＯＤＸ.ｅｔａｌ.Ｐｉｖｏｔａｌｒｏｌｅｓｏｆｃｏｒｅ￣ｃＧＡＳ￣ｃＧＡＭＰｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎａｎｔｉｖｉｒａｌｄｅｆｅｎｓｅａｎｄｉｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔｅｆｆｅｃｔｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３４１(６１５２):１３９０￣１３９４.(责任编辑:陈海霞)０６４江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期。

中国动物传染病学报2020,28(5):17-22Chinese Journal of A nimal Infectious Diseases •研究论文•1株3型禽腺病毒的分离鉴定牛登云，徐兆强，陈卓，马利芳，段宝敏，张小敏，冯敬敬(天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津300308)摘要：本研究旨在利用鸡肝癌(LMH)细胞从FAdV感染鸡的肝脏中进行病毒分离，利用PCR扩增与序列测定、TCID5。

测定以及鸡胚接种等方法对分离获得的1株3型禽腺病毒进行鉴定与分析。

结果显示：LMH细胞接毒96h左右会出现明显的细胞病变，细胞体积变大，形态边圆，折光度增强，贴壁性减弱，呈半悬浮状态；将分离毒株在LMH细胞上连续传代2〜3次会稳定出现明显的细胞病变；接种LMH细胞进行TCID50测定，病毒滴度达到10-7.67/0.1mL；将分离株接种鸡胚，96h后死亡，胚体发红萎缩，肝脏出血有坏死灶；PCR扩增分离株的Hexon基因，并进行其同源性和基因进化树分析显示，分离株目的基因与参考毒株SR-49位于同一分支上，同源性在99.4%，同时将分离株命名为SX180203。

本研究结果为禽腺病毒3型毒株疫苗的研发奠定了坚实的物质基础。

关键词：3型禽腺病毒；分离鉴定；Hexon基因中图分类号：S852.659.1文献标志码：A文章编号：1674-6422(2020)05-0017-06 ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A SEROTYPE3FOWLADENOVIRUS ISOLATENIU Deng-yun,XU Zhao-qiang,CHEN Zhuo,MA Li-fang,DUAN Bao-min,ZHANG Xiao-min,FENG Jing-jing(Tianjin Bohai Joint Institute of A griculture and Animal Husbandry Industry Co.,Ltd.,Tianjin30030&China)Abstract:Liver samples of infected chickens were inoculated onto LMH cells to isolate serotype3Fowl adenovirus(FAdV-3).The obtained isolate was designated as the strain SX180203and then characterized by PCR,sequencing,determination of TCID50and chicken embryo inoculation.The infected LMH cells showed obvious cytopathic effect at about96h post infection.The cells became larger,round and detached and cell monolayers peeled off in a semi-suspended state at the late stage of infection.Continuous2to3passages of the isolated viruses on LMH cells resulted in significant cytopathic effect.The determination of titer(log10TCID50/mL)were performed on LMH cells and the virus titer reached to log10107.67/0.1mL.The isolate was also inoculated into chicken embryos.The inoculated embryos died at96hours post inoculation.The embryos looked red in color and livers showed hemorrhage and necrotic foci.The PCR testing of Hexon gene revealed that this isolate was on the same branch as the reference strain SR-49,and their nucleotide homology was99.4%. Key words:Serotype3fowl adenovirus;isolation and identification;Hexon gene收稿日期：2019-02-12作者简介：牛登云，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：冯敬敬，E-mail：****************・18・中国动物传染病学扌艮2020年10月I群禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，为双链DNA病毒，无囊膜，直径为70~90nm,呈20面体对称结构。