8年制生物化学与分子生物学 第23章 DNA操作的基本技术

HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 平或钝末端（blunt end)
2020年11月12日6时19分
G CCTAG
+
GATCC G
粘端切口
粘性末端（sticky end)
12
2020年11月12日6时19分
13
2020年11月12日6时19分
14
2.酶切效率
限制性内切酶的活性单位定义为： 1小时内完全酶解1μg λ噬菌体DNA中所有相同酶
切点所需要的酶量。
影响酶切效率的因素：
（1）缓冲液：商品化的内切酶均提供高盐、中盐和低 盐缓冲液；进行双酶切时要遵循先低盐反应后高盐反 应的原则。
2020年11月12日6时19分
15
影响酶切效率的因素：
XmaI (413)
SmaI (415)
BamHI (418) PstI (440)
HindIII (448) MCS
Plac 多个酶切位点 Ori 用于克隆操作
ApaLI (1121)
分子量更小 拷贝数更高
2020年11月12日6时19分
33
蓝白斑筛选
有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互补(α互补)而成， 可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝 色菌落。
影响酶切效率的因素：
（6）加样顺序：配制酶切反应体系时酶要最后加。
（7）酶的稀释：商品化的内切酶都是浓度很高的浓缩 酶，使用时可用酶切缓冲液进行稀释，但不能用水进 行稀释，否则可导致酶失活。
限制性内切酶酶切中常见的问题和原因

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（二）原位PCR技术
• 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上单个细胞内进行PCR反应，然后用特异性探 针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是 否在该组织或细胞中存在。
• 原位PCR办法填补了PCR技术和原位杂交技术 不足，是将目的基因扩增与定位相结合一个最 佳办法。
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四、基因转移和基因剔除在医学 发展中作用
建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 •基因剔除 •取得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型
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第八节
疾病相关基因克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
第58页目录
克隆疾病相关基因策略 • 功效克隆(functional cloning) • 定位克隆(positional cloning)
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（一）功效克隆
定义 从对一个致病基因功效理解出发来克隆
该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表示产物较易得 到部分纯化遗传性疾病。
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• 利用酵母系统从功效学角度鉴定致病基因。 • 用不同人DNA片段转化与人类遗传疾病含
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一、蛋白质互相作用研究技术
惯用蛋白质互相作用研究技术 • 酵母双杂交 • 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） • 荧光共振能量转换效应分析 • 噬菌体显示系统筛选
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（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱 原理、分析蛋白质体外直接互相作用办法。
标签融合蛋白结合试验主要用于证实两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合详细结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合 未知分子。

基因工程（二）基因工程的基本操作程序编稿：闫敏敏审稿：宋辰霞【学习目标】1、理解获取目的基因的方法。

2、（重点、难点）理解基因表达载体的构建原理。

3、理解将目的基因到入受体细胞的方法。

4、理解目的基因的检测与鉴定可以采用不同的方法。

【要点梳理】要点一、目的基因的获取1、目的基因：编码蛋白质的结构基因。

2、目的基因的获取方法：①从供体细胞直接获取；②从基因文库中获取；③利用mRNA反转录形成；④利用PCR 扩增技术；⑤人工合成。

3、基因文库、基因组文库、cDNA文库概念及作用：基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库指含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库；有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。

5、PCR与生物体内DNA复制的比较要点二、基因表达载体的构建1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并在遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。

①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。

它是RNA聚合酶识别结合的部分。

②终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。

③标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因（目的基因是否导入成功）。

3、基因表达载体的构建方法：要点三、将目的基因导入受体细胞【高清课堂：基因工程（二）基因工程的基本操作程序 369166目的基因导入受体细胞】1、不同受体的导入方法目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。

转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。

（1）将目的基因导入微生物细胞（2）将目的基因导入植物细胞①土壤农杆菌转化法土壤农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物。

植物细胞受伤时，细胞分泌大量酚类物质，吸引农杆菌移向受伤细胞。

农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。

1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
方 法
样品＋等体积饱和苯酚
10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡 离心（12000×g） 取上清
核酸相 Protein变性相 有机相
4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH
重蒸：去除醌类氧化物 饱和： 防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 方法：蒸馏（183℃）0.1% 8-羟基喹啉-收集 （棕色瓶）-饱和与调pH≥7.8（TrisHCl pH8.0）-0.2%β-ME, 4 ℃或-20 ℃保存 8-羟基喹啉的作用：减少酚氧化、提供颜色（黄色）指 示、抑制RNA酶活力、螯合金属离子抑制DNA 酶活性、提取RNA时与VRC作用使酚由黄变黑。
二、 离心技术