包涵体蛋白的分离纯化
赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RN
A、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
1.包涵体的形成
重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时 ,都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体 ,一般含有 50%以上重组蛋白 ,其余为核糖体组分、RN A聚合酶 ,外膜蛋白等杂蛋白 ,以及质粒 DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点 , 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点 : ⑴蛋白合成速度太快 ,以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明 :蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应 ,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应 ,因此 ,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白 ,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统 (如糖基化等 ) ,致使中间体大量积累 ,容易形成包涵体;⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成 ,如发酵温度高 ,胞
内 pH 接近蛋白的等电点等;⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用 ,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫
键的形成;⑸包涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性 ,但在基因工程中生产重组蛋白 ,包涵体的形成有一定优势 ,主要表现在 :
⑴重组蛋白高水平表达 ,有时候可达细胞总蛋白的 30%;⑵包涵体密度高 (约 1. 3mg/m l)[ 12 ],重组蛋白相对较纯 ,很容易与细胞成分分离 ,可减少后续纯化步骤 ; ⑶包涵体结构致密 ,因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解 ; ⑷易于毒性蛋白和膜蛋白表达;⑸包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度 ,有利于目的基因的进一步表达。基于这些特点 ,重组蛋白的包涵体表达已在商业化生产中得到广泛应用。
2.包涵体的洗涤纯化
表达重组蛋白的宿主细胞通常在低温条件下用高压匀浆或超声进行破碎 ,或者用机械、化学与酶相结合的方法破碎。破碎大肠杆菌有效的方法是溶菌酶(1mg/m l)结合超声波进行处理。需要的注意的是控制超声功率和时间 ,超声不足不能完全释放重组蛋白 ,而超声时间太长或功率太大 ,会使蛋白炭化。由于包涵体具有很高的密度 ,细胞破碎液通过低速离心 (或者梯度低速离心 )]、过滤、即可除去可溶性蛋白和部分细胞碎片 ,达到收集包涵体目的。包涵体中除目的蛋白外 ,还有少量脂类、核酸、多糖和其它杂蛋白等 ,这些成分会影响目的蛋白的纯化和复性 ,因此在包涵体蛋白去折叠前应先洗涤包涵体。常用 EDTA、低浓度变性剂 (如尿素、盐酸胍 ) 、弱去污剂(如 Triton X2100、辛烷基葡糖苷、脱氧胆酸盐 ) 、还原剂(如二硫苏糖醇 DTT、β2巯基乙醇 )等。伴随着细胞破碎而释放的膜蛋白必须除去 ,例如大肠杆菌外膜蛋白 OmpT(37kDa在 8 mol/L 尿素中仍具有蛋白水解酶活性,如果洗涤不充分 ,则有可能在包涵体的溶解和复性过程中降解重组蛋白质 ,而且洗涤得到较纯的包涵体可简化后续色谱纯化的步骤。因此包涵体的洗涤非常重要 ,不可忽视。
包涵体蛋白分离纯化步骤复杂繁多 ,为了避免繁琐的操作 , Gu等用凝胶过滤方法实现了对原核表达的 ScFV52P包涵体蛋白的分离和洗涤。也可采用原位溶解 ( in situ solubilization)包涵体的处理方法 ,即用化学试剂或酶直接从发酵液里的细胞中溶解释放包涵体蛋白。将发酵液中的包涵体蛋白质原位溶解后 ,可以用超滤[ 19, 20 ]、双水相萃取[选择性萃取 ,或扩张床色谱等选择性捕集 ,或在高电场下使目的蛋白吸附在磁性微球上[方法 ,可以除去细胞碎片和宿主细胞蛋白 ,使得目的蛋白得到部分纯化。但这种原
位溶解的方式并不常见 ,它会使发酵液中的蛋白质和其他细胞内杂质都释放出来 ,不仅影响包涵体蛋白的后续纯化和复性 ,也对目的蛋白的表达水平提出了更高的要求。
3.包涵体的溶解与去折叠
溶解包涵体目前最常用的方法是用变性剂如尿素(6～8 mol/L )或盐酸胍 ( 4 ～6 mol/L )溶解 ,它们对蛋白质的氢键有较强的可逆性变性作用 ,可破坏蛋白质叠。尿素具有不电离、成本低、可直接进行 S DS2PAGE检测以及溶解的包涵体蛋白可选用多种色谱法纯化等优点被广泛应用 ,但尿素容易析出 ,作用时间较长或温度较高时会对蛋白质进行共价修饰。盐酸胍溶解包涵体能力较尿素强 ,作用快而不修饰蛋白 ,但成本高 ,酸性条件下易沉淀 ,还干扰离子交换色谱等。一般来说 ,用低浓度变性剂溶解包涵体得到的可溶性蛋白纯度比高浓度变性剂溶解的高 ,是因为变性剂浓度高时胞质颗粒蛋白也被释放出来。包涵体溶解还可添加去污剂]、还原剂[、螯合剂等 ,或在极端 pH、高温条件下进行。各种去污剂如SDS, CTAB, Tween 20, NP40,TritionX2100, Sarkosyl(月桂酰 2N2甲基氨基乙酸钠 )等常被用来溶解包涵体是因为其作用比盐酸胍和尿素更温和 ,溶解的蛋白质具有更多的有序结构 ,可能已经具有生物活性 ,避免了复性中的错误折叠。但是使用去污剂作为溶解剂可能会干扰后续纯化步骤。对于含有半胱氨酸的重组蛋白质 ,分离到的包涵体中常含有一些链间和链内非活性的二硫键 ,因此还原剂的使用非常重要。常用的还原剂有 DTT、DTE、GSH、β2巯基乙醇 ,还原剂可以过量 ,以保证半胱氨酸还原完全。
EDTA, EGTA等鳌合剂也被用来阻止金属离子催化的空气氧化反应 ,硫化物的形成或二硫化物混和物也可保护被还原的半胱氨酸。利用极端 pH 也可溶解包涵体。 Gavit等将低pH (≤2. 6)和高温 ( 8 5℃)相结合 ,并通过在位溶解的方式溶解抗真菌重组多肽包涵体。
