细菌活性检测方法Alamar Blue

alamar blue原理Alamar Blue是一种广泛应用于细胞生物学研究的荧光检测试剂，其工作原理是通过细胞代谢活跃度的变化来评估细胞的健康状况。

它的分子结构中含有呋喃环、叔胺基、氧化还原指示剂等功能基团。

在细胞内，Alamar Blue会被细胞代谢酶还原成一种具有强荧光的产物，荧光强度与细胞活性成正比。

下面我将详细介绍Alamar Blue的工作原理。

Alamar Blue的分子结构中含有呋喃环和叔胺基，这些结构使得Alamar Blue能够在细胞代谢过程中接受氢离子，并发生还原反应。

当Alamar Blue与细胞接触后，试剂会进入细胞内。

在细胞内，Alamar Blue被活性细胞代谢酶还原为还原型的Alamar Blue，称为resazurin。

这个还原过程是一个氧化还原反应，将Alamar Blue中的蓝色氧化剂还原为无色还原型剂。

还原型的Alamar Blue（resazurin）是一种具有荧光的化合物，可通过荧光显微镜或荧光板阅读器来检测。

荧光强度与细胞的代谢活性呈正相关关系。

因此，通过测量Alamar Blue的荧光强度，可以评估和监测细胞的代谢活性。

测量Alamar Blue的荧光强度通常使用荧光板阅读器进行。

阅读器通过在特定波长下激发荧光素，然后测量发射的荧光信号。

在Alamar Blue检测中，通常使用波长为530-570 nm激发荧光素，然后在590-620 nm范围内测量发射的荧光信号。

Alamar Blue检测方法可以用于评估细胞活力、细胞毒性、药物毒性、细菌抗生素敏感性等。

在实验中，将待测的细胞接种在含有Alamar Blue试剂的培养基中，培养一定时间后，通过测量荧光强度来评估细胞的健康状况。

荧光强度较高表示细胞活性较高，荧光强度较低则表示细胞活性较低。

Alamar Blue的优点包括灵敏度高、操作简便、快速、无毒性等。

与传统的细胞存活检测方法相比，Alamar Blue能够提供更直观、准确、定量的结果。

如何判断细胞的活性细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,检测方法如下：一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。

可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。

使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。

能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。

其中最常用的是台盼蓝染色法。

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。

通过细胞计数可得出细胞的存活率。

本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。

但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。

2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。

如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。

吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。

溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。

这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。

在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。

而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。

二、克隆（集落）形成试验克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。

一般情况，每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm3之间。

微孔板Alamar blue显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的研究郑玉红;郭倩;李超;魏剑浩;赵丽丽;蒋毅;赵秀芹;万康林;李桂莲【摘要】目的评价微孔板Alamar blue显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的可行性.方法用微孔板Alamarblue显色法对78株结核分枝杆菌检测氧氟沙星的最小抑菌浓度,记录获得结果时间,利用ROC曲线确定氧氟沙星的最佳耐药阈值,并和传统的药物敏感性实验罗氏培养基比例法进行比较.结果微孔板Alamar blue 显色法获得结果平均时间为8d,氧氟沙星的最佳耐药阈值为2μg/mL,以罗氏培养基比例法为金标准,氧氟沙星的灵敏度和特异度分别为88.6％和94.1％.结论微孔板Alamar blue显色法是一种简便、敏感、快速的药物敏感性检测方法,可用于结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的快速检测.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)006【总页数】4页(P537-540)【关键词】结核分枝杆菌;氧氟沙星;耐药性;Alamar blue显色法【作者】郑玉红;郭倩;李超;魏剑浩;赵丽丽;蒋毅;赵秀芹;万康林;李桂莲【作者单位】传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;南华大学病原生物学研究所,衡阳 421000;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;温州医学院,医学检验省部共建教育部重点实验室,温州 325035;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;温州医学院,医学检验省部共建教育部重点实验室,温州 325035;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州 310003;传染病预防控制国家重点实验室,传染病预防控制所,中国疾病预防控制中心,北京102206;感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003【正文语种】中文【中图分类】R378.91近年来，耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出现使结核病控制面临严重的挑战。

Alamar Blue测细胞增殖及相关细胞毒性检测一、实验原理AlamarBlue是一种安全、稳定、易溶于水、且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。

已被用于检测淋巴细胞、贴壁或不贴壁的人及动物细胞株、细菌及真菌的增殖；多种化学物质的细胞毒性试验；细胞凋亡的量化以及细胞介导的细胞毒性试验。

避光储存于2—8℃，20个月。

活细胞能够将蓝色的氧化形式AlamarBlue变成红色的还原形式，同时发生可量化的荧光变化，无活性的细胞不能还原AlamarBlue.荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度.其颜色变化可用酶标仪测定，由于氧化和还原的吸收光谱可形成重叠，需测定570nm(还原)和620nm（氧化）两个波长处的OD值,OD570减去OD620得到的吸收值即反映了试验中细胞增殖的相对水平;其荧光变化可用荧光测定仪检测,激发波长530nm，散射波长590nm,使用荧光方法敏感性更好。

二、实验试剂①AlamarBlue;②3％SDS（配制:pH 7.4，3％SDS 用磷酸盐缓冲液(PBS）溶解)三、实验材料①细胞.(适宜的培养基培养）②培养板(96—/384孔培养板)四、实验步骤药物处理完成后进行alamarBlue试验.备注:96孔板中,将alamarblue和培养基1:9混合后直接加入细胞中，(90uL含药培养基+10uLAB）/well，或者先换成无血清培养基40uL+AB10uL,孵育6h以上,再加入培养基50uL，作用n小时后开始上机检测。

细胞数2500—5000/well最好，54h终点。

2、37℃，5%CO2，培养1—4h，注意避光;待培养基的颜色由靛蓝青开始变成粉红色即可进入下一步.(也有说2-6h，且为增加灵敏度可延长至24h，HepG2孵育6h以上；培养时间因细胞不同有所差异，alamarblue法可以在多个时间点观察，实验人员可自行摸索）3、测定荧光或吸光度，吸光度和荧光强度与活细胞数成正比。

实验室常用细胞表征及处理方法一、细胞培养1.1细胞培养基配方普通细胞所需要的培养基配方主要为：购买的培养基+10 %血清（小牛或者胎牛）+1%双抗。

（常用的双抗及胰酶建议直接购买）1.2细胞传代1.2.1洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加入2~3ml PBS缓冲液洗涤2-3次，摇晃使其均匀铺满整个平面，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的血清和死细胞。

1.2.2消化：加入适量（盖满细胞层表面即可，25cm2的培养瓶加入0.5-0.6mL 即可，75 cm2加入1.0mL）的0.25%胰蛋白酶液，轻轻摇晃，普通细胞一般需要60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37℃孵箱孵育适当的时间，如Hela细胞大约需要30s-40s，翻转培养瓶。

然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况,待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙，即可终止消化（若细胞成片收缩，倒去消化液）。

若存在细胞团，可以轻轻拍打培养瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会非常困难。

1.2.3终止消化：在培养瓶中加入1-3ml培养液（胰酶遇血清会终止其活性）以终止消化。

用吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边角部分特别注意多次吹打。

可在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。

将单细胞悬液移入15ml离心管内,离心1000r×5min,弃去上清液,加入5ml 培养基进行吹打重悬（也可不用离心，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶里，补加适量培养基）。

小培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养皿5-7ml，以上均应视细胞的数目而定，细胞多，可适当加多些培养基）。

1.2.4.传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进行细胞悬液计数，然后按所需密度接种到其它培养瓶中。

标注上代数、日期及操作人。

注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋白酶液均需37℃预热处理。

检测原理阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸亮度变化和荧光信号。

这是一种安全无毒的染料，可用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及细胞因子生物测定和体外细胞毒性研究，能有效测定动物、真菌和细菌细胞的天然代谢活性。

Alamar Blue在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，反映所研究的细胞或微生物对氧分子的消耗，因而常被用作氧化还原指示剂，以显示被观察细胞和细菌的代谢活动。

这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力。

在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN 和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。

摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。

受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，因此对应的信号较低。

可以用普通分光光度计或荧光光度计检测，其激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。

本品可广泛地用于细胞增殖代谢，药物的细胞毒作用的体外测定以及病原微生物的的快速检测与鉴定。

与台盼兰、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue具有更多的优势。

Alamar Blue采用单一试剂，可以连续、快速地检测细胞的增生状态。

由于Alamar Blue对细胞无毒、无害，不影响细胞的抗体合成与分泌等活性，因此可以对同一批细胞的增生状态进行连续观察和进一步的实验观察，因此有操作简便和几乎不干扰细胞正常代谢的特点。

运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。

产品4ºC避光保存，至少一年有效。

注意事项1）需客户自行准备100%还原型Alamar Blue试剂。

为得到还原型Alamar Blue，需配制Alamar Blue与（不能对浓缩的Alamar 细胞培养基的混合溶液，Alamar Blue与细胞培养基的比值为1:10，高压灭菌15min。

细胞增殖检测方法简介1.检测细胞代谢活性检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。

在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。

通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1，其还原产物为甲瓒(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)：MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。

1983年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。

其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶，甲瓒并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。

二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。

因此，MTT主要作为终点检测方法。

另外，有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95％的MTT与O2-的反应，MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。

(2)二甲氧唑黄比色法(XTT)：XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度，故较MTT法更加快速、简便、敏感。

但XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用。

由于XTT的代谢产物呈橘黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。

与MTT一样，过氧化物可抑制近95％的XTT与O2-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。

(3)内盐法(MTS)：MTS是一种新型的MTT类似物。

MTs在偶联剂PMS存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。

alamar blue原理
Alamar Blue是一种常用于细胞活力和细胞增殖实验的染料，其原理基于氧化还原反应。

Alamar Blue的活性成分是刃天青（resazurin），它是一种无毒性、可透膜的蓝色染料，具有微弱的荧光性。

刃天青在细胞内吞后，会被细胞内的还原剂还原为一种红色的化合物（testrol blue），这种转化通常与细胞的代谢活性相关。

Alamar Blue的检测原理如下：
1.细胞内吞：活细胞会通过内吞作用将刃天青染料吸收进入细胞内。

2.还原反应：在细胞内，刃天青会被还原为红色的test rol blue。

这种还原反应通常需要细胞内的还原剂，如NA DH或NADPH，这些还原剂是细胞代谢过程中的产物。

3.荧光信号：testrol blue的红色荧光可以通过荧光显微镜检测到，或者通过光度计测量吸光度的变化。

这种荧光信号的增加与细胞的代谢活性和增殖能力相关。

4.数据分析：通过测量细胞内testrol blue的量或荧光信号的强度，可以定量地评估细胞的活力和增殖情况。

Alamar Blue的优点是它是一种相对简单、快速且非侵入性的细胞活力检测方法。

它可以在不破坏细胞的情况下，提供关于细胞健康和代谢活性的信息。

因此，Alamar Blue
在细胞生物学研究和药物开发等领域中得到了广泛应用。