包埋法固定化微生物技术1

酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。

（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。

（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。

（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。

b.提高了果糖的产量和品质。

2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。

（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。

二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。

葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。

活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。

2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。

实验三固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1. 掌握包埋法固定化酶的操作技术。

2. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。

3. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。

【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。

酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。

测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。

酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。

由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。

碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。

酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。

（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。

）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。

所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。

在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。

固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。

酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。

载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。

一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。

最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。

① 共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。

在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。

固定化微生物技术在环境工程中的应用探究摘要：当前，在经济发展过程中越来越强调环境保护，环境工程的重要性日益凸显。

在环境工程中利用微生物处理技术可以有效处理生产和生活中产生的各种废弃物，并通过发酵、分解减少污染，必要时还可以通过该技术提取可回收利用的资源，充分提高资源利用效率。

基于此，本文分析了造成环境污染的主要因素，并通过探究有效微生物的构成，分析了微生物处理技术及其应用情况。

关键词：固定化微生物技术；环境工程；废水处理1 固定化微生物技术在环境工程领域的应用现状1.1 污水处理通常，污水处理用到的固定化微生物技术主要分为活性污泥法和生物膜法。

除部分微生物分布于相对较为固定的物质上外，微生物通常以自然形成的形式分布于菌胶团上。

为使污水得到较为理想的净化处理，微生物需要维持较高的浓度水平，同时在载体上保持长时间的固定。

对于难降解的工业废水，这类污水通常含多种有机污染物和重金属物质，采用固定化微生物技术可将这些污染物与污水成功分离，降低污水的有机污染物与重金属浓度，从而达到有效的污水处理效果。

例如，采用此技术对印染废水进行处理时，通过固定混合脱色菌对印染废水进行处理的脱色率可达到约85%。

对于低碳氮比的高浓度氨氮废水，利用固定化微生物技术进行处理已初步取得明显成效。

这类废水易导致水体富营养化，对水体生态平衡产生很大的破坏，且采用传统生物方法对这类废水进行处理时需要额外添加碳源，增添成本与操作难度。

固体化微生物技术在一定条件下通过某些载体材料可解决碳源不足问题，同时也能处理低碳氮比的废水。

1.2 处理固体垃圾由于固体垃圾会在环境中长期存在，从而产生大量细菌，对环境造成了严重污染。

且固体垃圾的成分较复杂，很难从污染物中完全去除，同时，也会在一定程度上加剧污染。

而应用环境工程中的其他处理技术，难以达到理想的效果，还会造成二次污染。

因此，利用微生物技术处理固体垃圾，其中的湿微生物实现了固体废物的分解，同时，可将分解的物质作为生产原料。

酵母细胞的固定化技术学习目标：1.简述固定化酶、固定化细胞的应用、原理和意义；2.说出制备固定化酶、固定化细胞的一般方法；3.尝试用包埋法制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行发酵。

课前导学：一、固定化酶技术的应用1．固定化酶：是指用物理学或化学的方法将___________与_______________结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。

2. 制备固定化酶的方法主要有：______________、交联法、______________等。

二、固定化细胞技术1．固定化细胞：通过各种方法将________与_________结合，使细胞仍保持原有的生物活性。

2. 固定化细胞的方法：吸附法和两大类。

3．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点比较(一)制备固定化酵母细胞1．活化酵母细胞：活化就是处于________状态的微生物重新恢复正常的生活状态。

2．配制CaCl2溶液：3．配制海藻酸钠溶液：溶解海藻酸钠，最好采用酒精灯的方法，直至海藻酸钠完全融化。

如果加热太快，海藻酸钠会发生。

4．海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合：一定要将溶化好的海藻酸钠溶液________，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器。

5．固定化酵母细胞：以的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，逐渐形成凝胶珠。

(二)用固定化酵母细胞发酵1．制备麦芽汁：2．将固定好的酵母细胞用冲洗2-3次。

3．将固定好的酵母细胞凝胶珠加入无菌麦芽汁中，温度为℃。

（三）实验结果的观察：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。

质疑讨论：1．在固定化酶时，一般宜采用什么方法？固定化细胞时，又适宜采用什么方法？2．海藻酸钠溶液的浓度对实验有什么影响？3．怎么判断凝胶珠制作是否成功？例题精讲：1．固定化酶的优点是 ( ) A．有利于增加酶的活性 B．有利于产物的纯化C．有利于提高反应速度 D．有利于酶发挥作用2．酶的固定化常用的方式不包括 ( ) A．吸附 B．包埋 C．连接D．将酶加工成固体3．固定化细胞常用包埋法而不用吸附法固定化，原因是 ( ) A．包埋法固定化操作最简便 B．包埋法对酶的活性影响最小C．包埋法固定化具有普遍性D．细胞体积大，难以吸附或结合4．如下步骤是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞（1）在状态下，微生物处于休眠状态。

固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。

作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。

由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。

但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。

由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。

酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。

由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。

如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。

从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。

随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。

对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。

一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。

第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。

目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。

探究固定化微生物技术【摘要】固定化微生物技术是是应用于环境处理的一项新技术，本文通过总结专家学者的研究概述了固定化微生物技术的载体种类及固定化小球的制备方法。

【关键字】固定化微生物技术；载体材料；制备方法固化微生物技术是20世纪70年代末发展起来的一项现代生物、环境等领域中的新兴技术。

该技术是运用物理或者化学等方法，将游离的细胞或酶与固态的非溶性载体相结合，将其限制于有限的空间区域内，使其不溶于水但保持活性，并可反复和连续的使用。

它主要包括固定化酶技术和固定化微生物技术。

固定化微生物技术与传统的活性污泥法相比，存在着明显的优势，主要体现在：（1）生产工艺连续化和自动化；（2）污泥产量少，减轻了后期处理污泥的负担，降低工程投资成本和造价；（3）生物密度高，有利于降解有毒有害物质；（4）耐受能力强且易于回收再利用，大多数载体材料市场价格低廉；（5）固液分离效果好，可纯化和保持高效菌种；（6）不会造成环境二次污染；（7）微生物被固定后，细胞内相当于一个反应器，酶系保存完整。

1 固定化载体材料1.1 固定化材料的性能要求固定化小球载体材料的选择是固定化微生物技术中的关键步骤之一。

其要求成本低廉、易于制成各种形状、抗冲击能力强、性质稳定、对固定的微生物无毒、在常温下固化快、传质性能好、寿命长、小球的基质具有通透性，单位体积的载体固定的微生物的数量多等。

1.2 固定化材料的种类固定化材质分为三大类：（1）有机高分子载体，分为天然高分子载体材料和合成有机高分子载体材料。

其中天然高分子载体材料包括琼脂、角又莱胶、海藻酸钠、无烟煤、卡拉胶、海藻酸钙、葡萄糖、纤维素、明胶、胶原蛋白等，合成有机高分子载体材料包括离子交换树脂、塑料、聚丙烯酰铵、聚乙烯醇、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。

天然高分子材料具有无毒性、传质性好、固定化微生物密度高等特点，但是其强度低、抗微生物分解能力较差。

可以通过交联剂对其进行稳定化处理。

而有机高分子材料抗微生物分解性能好、强度高、性质稳定、对微生物无毒且价格低廉，因而具有很高的利用价值。

课题3酵母细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞技术 [自读教材·夯基础]1．概念利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

2．方法(1）包埋法：多适于细胞的固定化；（2） ｝化学结合法物理吸附法多适于酶的固定化。

3．载体包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料,如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。

1．固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而固定化细胞则常采用包埋法。

2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化―→配制CaCl 2溶液―→配制海藻酸钠溶液―→海藻酸钠与酵母细胞混合―→固定化酵母细胞。

3．配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶珠;若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响实验效果。

4．配制海藻酸钠溶液应小火加热或间断加热。

5．固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重复利用，降低了成本，又提高了产品质量.4．优点(1)固定化酶既能与反应物接触,又能与产物分离，可以反复利用.(2）固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。

5．实例-—高果糖浆的生产（1）原理：葡萄糖错误!果糖。

(2）生产过程:①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入.②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。

③转化成的果糖，从反应柱的下端流出.（3）反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板.酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。

(4）优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。

要想既降低生产成本,又不影响产品质量，该如何解决这一问题?提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触,又能与反应物分离，还可重复利用。

2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么?提示:固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。

因酶分子小，易从包埋材料中漏出,故一般不用包埋法进行固定。