转基因 抗虫甘蓝

甘蓝型油菜花柄遗传转化体系的创建刘洋;徐漫;赵德刚【摘要】为获得转基因油菜植株,以甘蓝型油菜品种特选4号花柄为外植体,确定了不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,并进行了花柄外植体的转化试验,得到了抗卡那霉素(Kan)植株,并对影响转化的一些因素进行了研究.结果表明:卡那霉素对芽再生均具有很强的抑制作用,最佳筛选浓度为15 mg/L；花柄外植体在MS+3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L2,4-D培养基上预培养72h时,经农杆菌(OD600≈0.4)侵染3 min后共培养2d,获得了抗卡那霉素并通过PCR鉴定和GUS 报告基因检测的转基因植株15株,遗传转化效率为5.19％.%In order to obtain transgenic rape plants, a transformation test was conducted taking the flower stalk of B. napus cultivar Texuan 4 as the explants, and Kan-resistant plant was obtained, some factors affecting transformation were studied. The results showed that the optimal adventitious buds induction medium was MS+6-BA3. 0 mg/L + NAA 0. 1 mg/L, and the optimal kanamycin concentration for screening was 15 mg/L. When flower stalk explants were precultured on the MS medium containing the combination of 1. 0 mg/L 2. 4D and 3 mg/L 6-BA for 72 hours,and then infected with A. tumefaciens (OD600 =0. 4) for 3 minutes and co-cultured for two days, 15 kanamycin resistance plants were obtained and passed PCR identification and GUS detection. The transformation frequency reached 5. 19%.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2013(041)002【总页数】5页(P1-5)【关键词】油菜;花柄;外植体;遗传转化【作者】刘洋;徐漫;赵德刚【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S565.403.2油菜系十字花科芸薹属植物，分为白菜型（Brassica rapaL.）、芥菜型（Brassica juncea L.）和甘蓝型（Brassica napus L.）3种栽培种，其中，甘蓝型油菜在全球的种植面积最为广泛，芥菜型次之，白菜型最少。

从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
2． 植物细胞杂交
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
因动物”是指
( )。
A．提供基因的动物
B．基因组中增加外源基因的动物
C．能产生白蛋白的动物
D．能表达基因信息的动物
解析 转基因生物是指利用基因工程技术导入外源基因培育
出的能够将新性状稳定地遗传给后代的基因工程生物。转基
因动物是指基因组中增加了外源基因的动物，题中的转基因
牛中携带有外源的白蛋白基因。
答案 B
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
2．转基因动物的实例 (1)1982年美国科学家将大鼠的_生__长__激__素__基__因__注射到小白 鼠的受精卵中，获得第一只转基因“超级小鼠”。 (2)动物转基因技术的应用：提高产仔数或产蛋数；提高 _抗__病___能力；研制乳腺_生__物__反__应__器__；提高动物生长速率 ；改善肉的品质。
误的是
( )。
A．进行植物细胞融合必须先制备原生质体
B．番茄和马铃薯属于同一个物种
C．植物细胞杂交过程需要植物组织培养技术支持
D．这种“番茄—马铃薯”很可能是可育的
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。

农杆菌介导DR1172基因转化甘蓝型油菜的研究张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【摘要】耐辐射奇球菌(Deinococcus.Radiodurans,DR)能在极端胁迫条件下生存,并且拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛用于研究.其中DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因,与LEA76家族同源,参与植物的抗旱机制.本研究利用基因工程手段以载体pBI121为基础构建了植物DR1172-EHA105表达载体,然后利用农杆菌介导法将目的基因DR1172转入油菜中,得到再生油菜植株97株,阳性植株48棵,转化植株阳性率为49.48％.该研究为探讨DR1172基因的功能以及植物抗逆性提供了丰富的植物材料,而且对利用生物工程技术手段改良植物性状,培育出抗逆性强的植物优良品种有重要的指导价值.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2013(032)002【总页数】6页(P51-56)【关键词】DR1172基因;载体构建;基因工程;油菜【作者】张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所,北京100084【正文语种】中文【中图分类】Q7850 引言耐辐射球菌(Deinococcus.Radiodurans，DR)是1956年由美国科学家Anderson等从X－射线灭菌处理后的肉罐食品中发现的一种红色的非致病性球菌，它是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之一，因对电离辐射、紫外线、干燥及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视［1］.耐辐射奇球菌R1属可以在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能.据预计，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［2］.DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因，该基因全长897bp，属于LEA第三族的基因，其功能目前尚未见报道.第3族的LEA蛋白一般含有多拷贝的11个氨基酸组成的基元序列(TAQAAKEKAGE)［3］.该族大多数氨基酸残基为碱性以及亲水性氨基酸，未见半胱氨酸和色氨酸，这些氨基酸残基通常附带高电荷可以结合细胞内的水分子和盐离子，避免了干旱胁迫时对植物细胞的损伤，同时也可防止植物组织过度脱水［4，5］.对于第3族LEA蛋白的功能及其生理作用目前并没有确定的结论，所以此类蛋白有广阔的研究前景［6］.在种子富集的一类脱水保护蛋白被命名为LEA蛋白，该类蛋白首先发现于棉花子叶之中［7］，不仅是在胚胎发育后期，在其它的个体发育阶段，LEA蛋白的表达也能在ABA诱导或干旱脱水的胁迫下高水平表达.LEA蛋白主要是保护膜结构的稳定性，能够在干旱胁迫条件下减轻植物伤害.LEA蛋白基因的表达与植物的渗透胁迫抗性呈现正相关.虽然关于LEA蛋白行使功能的具体机制仍不十分清楚，但是在植物受到水分胁迫时通常都伴随着LEA蛋白的积累，异源表达发现某些LEA蛋白可以增强转基因植物和酵母菌对水分胁迫的抗性［8］，最近有研究发现，LEA蛋白的积累与植物抗性存在一定的相关性［9］.DR1172与LEA76家族同源，LEA76蛋白质参与植物的抗旱性，而且相似的DR1172基因在植物脱水反应中诱导产生某些蛋白质产物，这些间接证据表明DR1172可能为抗旱性相关的基因.油菜是十字花科芸薹属植物，是世界上最重要的油料作物之一，主要分布在中国、加拿大和欧洲等国家和地区，具有重要的经济价值.但是，随着近年来气候条件的变化和环境的破坏，干旱、盐害、高温等外界胁迫对油菜的正常生长造成了不同程度的影响.本研究利用基因工程手段构建植物DR1172－EHA105表达载体，将DR1172转入油菜中，得到转基因油菜，为后续的研究提供了丰富的植物材料，为研究DR1172的功能以及LEA蛋白的功能奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义.1 实验材料1.1 植物材料甘蓝型油菜(Brassica napus L.)84100－18(玻里马细胞质雄性不育恢复系)由四川大学生命科学院植物遗传室提供，在本实验室温室中栽种.1.2 菌株DR1172+Z3(DR菌内与干旱相关的基因DR1172与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌JM109，pBI121，JM109，EHA105 标点符号.2 实验方法2.1 构建DR1172－EHA105植物表达载体2.1.1 DR1172基因的引物设计利用生物软件primer5设计了该基因的上下游引物(由华大基因合成分别命名为DR1172－F，DR1172－R)，根据PBI121质粒图谱分别引入XbaI，SacI限制性酶切位点，引物序列如下:2.1.2 PCR扩增目的基因DR1172用天根的普通质粒小提取试剂盒(TIANGEN)提取DR1172+Z3质粒，以此为模版进行PCR.2.1.3 PCR产物的胶回收PCR经电泳检测后，使用(TIANGEN)琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收扩增片段.2.1.4 DR1172基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定⑴ 胶回收后的DR1172基因和pBI121质粒分别用XbaI，SacI(购自Takara公司)双酶切，37℃酶切过夜，回收目的片段⑵将酶切回收的基因片段和pBI121质粒片段，16℃连接过夜，重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞⑶阳性克隆检测:挑取经过转化的JM109单克隆，菌落PCR初步鉴定，将PCR检测出的阳性克隆摇菌后送华大基因测序2.1.5 测序成功的JM109菌落，提取质粒，构建DR1172－EHA105植物表达载体.2.2 利用农杆菌介导法转化油菜，完成油菜细胞核的遗传转化2.2.1 主要培养基:(1)LB液体培养基:细菌培养用胰化蛋白胨10 g，细菌培养用酵母提取物5 g，NaCl 10 g，溶解于ddH2O 中，定容至 1L，pH7.0，高压灭菌.(2)转化培养基农杆菌摇菌培养基:LB+Rif 40 mg/L+str 20 mg/L+Kan 50 mg/L预培养基:MS+6 －BA 2.0 mg/L+2，4 －D 1.0 mg/L+AgNO32.5 mg/L+AS 100 μM筛选培养基:MS+6 －BA 2.0 mg/L+AgNO32.5 mg/L+Kan 10 mg/L+Cab 500 mg/L生根培养基:1/2MS+NAA 0.15 mg/L+Cef 250 mg/L2.2.2 农杆菌介导DR1172基因转化油菜过程:(1)预培养:用灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约0.5 cm长的下胚轴，置于预培养基上，光照预培养2 d.(2)农杆菌的培养:在50 mL LB液体LB摇菌培养基中加入0.1 mL DR1172－EHA105菌液，28℃下220 rpm振荡培养16 h左右，室温下4000 rpm离心10 min，弃上清夜，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100 μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5－20倍，在28℃下220 rpm振荡培养1 h，使菌液的OD600=0.5左右. (3)共培养:把预培养2 d的下胚轴放入农杆菌液中浸染1 min，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再将接种于覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，23℃暗培养2 d.(4)诱导培养:把共培养2 d的下胚轴放在诱导养基上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每两周继代一次，直至长出膨大的愈伤组织.(5)筛选培养:把共培养2 d的下胚轴接种至筛选培养基上筛选培养，用封口膜封好培养皿，25°C左右光照培养，每两周继代一次，经过4轮筛选培养，再生出小苗.(6)生根培养:当幼芽长到1－2 cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养进行生根培养.(7)幼苗的移栽:将已经有发达根系的幼苗经过1－2 d炼苗后转入土中生长.3 结果3.1 pBI121－1172质粒的构建结果.3.1.1 电泳结果如图1显示DR1172质粒的提取，电泳结果见图A.从图中可以看出，所提基因条带整齐，无弥散现象，可以用于PCR扩增.3.1.2 DR1172基因的扩增利用DR1172－F以及DR1172－R引物扩增DR1172基因，电泳结果如图B.DR1172大小为897bp，电泳结果正确，且条带特异.PCR 产物进行胶回收，电泳结果如图C.3.1.3 DR1172胶回收产物进行XbaI，SacI双酶切电泳图如图D，胶回收验证如图E，pBI121质粒进行XbaI，SacI双酶切，电泳图如图F，胶回收验证如图G.电泳结果显示经过双酶切后，DR1172以及pBI121有相关片段被切开，尤其pBI121很明显的被切成了大小两个片段.胶回收显示回收到的片段单一，没有杂带.3.1.4 酶切后产物连接转化JM109菌落PCR部分结果如图H，结果显示有73%显示了阳性条带，阳性克隆送去测序，测序结果正确的单菌落占了25%，阳性单菌落用于后续转化.测序结果:经过DNAStar分析与Genbank中报道的DR1172序列同源性为100%，可以确定DR1172外源基因导入到了大肠杆菌中.图1 pBI121－1172质粒的构建结果Fig.1 pBI121－DR1172 clone in JM109A －H中M为DL2000 MarkerA:DR1172+Z3质粒DNA电泳条带A:Agarose gel electrophoresis of DR1172B:DR1172扩增条带B:Agarose gel electrophoresis of PCR productC:DR1172 PCR胶回收验证C:Agarose gel electrophoresis of DNA extractionD:DR1172双酶切电泳图D:Agarose gel electrophoresis of DR1172 digested productsE:DR1172双酶切后胶回收电泳图 E:Agarose gel electrophoresis of DR1172 digested products，extractionF:pBI121双酶切电泳图F:Agarose gel electrophoresis of pBI121 digested productsG:pBI121双酶切后胶回收电泳图 G:Agarose gel electrophoresis of pBI121 digested products，extractionH:JM109菌落PCR验证H:1－10:PCR products ofJM109 with pBI121－DR1172 clone 11:negative control;12:positive control;3.2 DR1172－EHA105植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化EHA105感受态，得到的单菌落进行菌落PCR验证，结果如图2.由图2中可以选择5，10，12，15，16号保菌做浸染油菜用，阳性率为30%.图2 DR1172－EHA105的菌落Fig.2 Analysis of DR1172－EHA105M为DL2000 maker，1为水对照，17为阳性对照，2－16为单克隆菌落PCRM:DL2000 Marker;1:negative control;17:positive control;2－16:PCR products of EHA105 with pBI121－DR1172 clone3.3 转DR1172基因油菜体系的建立及抗性苗的获得3.3.1 转DR1172基因油菜体系的建立再生植株(如图3)表明:总共侵染2万余个外植体，共获得卡那霉素抗性植株97株，对其进行PCR检测，有48株显示出阳性，具有抗性诱导植株的阳性率为49.48%.造成假阳性的原因可能是卡那霉素的筛选强度不足以及剪下了外植体的生长点.3.3.2 卡那霉素抗性油菜的PCR检测将具有卡那霉素抗性的转化植株进行PCR检测，部分结果如图4所示.卡那霉素抗性植株有清晰的897bp大小的扩增条带，与质粒阳性对照相符，而阴性对照(未转化苗)没有，说明外源DR1172基因已进入到受体植物细胞.共检测出48株阳性植株.图3 转基因油菜的再生Fig.3 Regeneration of transgenic rapeseedA:抗性愈伤B:抗性芽C，D:生根培养E:移栽成活苗A resistant callus B:resistant shootsC，D:Induction of root regenerationE:Transplant transgenic rapeseed4 讨论通过NCBI数据比，发现DR1172属于耐辐射奇球菌R1属的一段基因，与LEA第三族的基因同源，其功能尚未见报道.而耐辐射奇球菌(D.radiodurans，DR)是迄今地球上发现的辐射耐受性最强的生物之一［1］.耐辐射奇球菌R1属(DR1)可以在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能，据预计，在耐辐射球菌R1中抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［2］.DR1172是一个与LEA76家族同源的基因，大量间接证据表明，LEA76蛋白质参与植物抗旱性.由此推断DR1172基因转入植物中可能会提高植物抗旱性，培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响.图4 转DR1172基因油菜PCR检测Fig.4 PCR test of DR1172gene in transgenic plantsM:DL2000 maker;1，18，35，52:阴性对照(未转化苗);17，34，51，68:阳性对照(质粒);其余:卡那霉素抗性植株M:maker 1，18，35，52:Negative controls(WT);17，34，51，68:positivecontrol(plasmid);others:Transformed plants目前，通过基因工程的手段，将外源基因转入到油菜中，在增强其抗性的同时，不影响油菜的产量和品质已受到越来越多的关注并取得了一定的结果［11－15］.本研究选择了油菜植物导入DR1172基因.通过基因工程手段使作物获得抗旱，耐盐抗寒等方面的优良性状，应用的越来越广泛.和传统的育种工作相比，具有周期短，可利用基因资源广泛的优势，具有广阔的应用前景.DR1172基因作为外源基因，以pBI121为载体，通过双酶切，连接，转化等步骤构建的DR1172－pBI121载体带有GUS基因，以及CaMV35S强启动子和NOS终止子，调控DR1172基因在植物中表达，带有Kan基因，可以进行抗性筛选.利用冻融法将植物表达载体DR1172－pBI121导入农杆菌EHA105，利用用根癌农杆菌介导转录因子基因DR1172转化油菜，成功的将DR1172导入植物中.通过PCR检测在大约900bp处出现亮条带，以此得出结果DR1172基因已经成功整合入油菜中.在农杆菌介导法浸染油菜的过程中，影响转化成功率的原因很多，包括外植体的强壮程度、预培养的时间、农杆菌的浓度、农杆菌侵染的时间等都对转化结果起着至关重要的作用.本研究针对DR1172的遗传转化，选取油菜下胚轴靠近茎尖生长点下方0.5 cm左右的茎段，在含有乙酰丁香酮(AS)和酚类物质的培养基中预培养2 d.用农杆菌介导法对甘蓝型油菜进行DR1172遗传转化采用OD值为0.4的MS重悬菌液侵染外植体90 s后进行暗培养.在接下来的筛选过程中每半个月必须更换一次培养基，因为培养基使用过久，其中的营养成分会被消耗，乙烯的含量增加，有害物质积累，从而会抑制生长素类物质的运输，从而使组织培养中的外植体褐化死亡或植株发育畸形，导致转化率降低.本实验以6 d苗龄的甘蓝型油菜下胚轴为材料，通过农杆菌介导将DR1172导入，获得抗卡那霉素的抗性植株97株，经PCR检测后得到48株阳性苗.本研究预期目标是构建植物表达载体，获得转基因阳性植株，为后续的植物抗逆研究奠定基础.该项研究获得了转DR1172阳性油菜，为鉴定DR1172在植物中的作用提供了丰富的植物材料，而且对应用基因工程手段改良和培育植物优良品种具有重要的现实意义.参考文献:［1］Anderson，A.W.，Nordon，H.C.，Cain，R.F.，.et al.Studies on a 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（思进注，注意到，每次转发国家级媒体《科技日报》等有公信力媒体的转基因科普文章，都会引来一群喷子！请问这些喷子，在科学问题上，你们不信科学家，你们信谁？！事实上，但凡长久关注我的网友都知道，我对于转基因农业的基本观点清晰明了：一是确保安全，二是要自主创新。

也就是说，在研究上要大胆，在推广上要慎重。

转基因农作物产业化、商业化推广，要严格按照国家制定的技术规程规范进行，稳打稳扎，确保不出闪失，涉及安全的因素都要考虑到。

要大胆创新研究，占领转基因技术制高点，不能把转基因农产品市场都让外国大公司占领了。

并反对非法种植！我从不推销任何转基因食品，更不强迫任何人吃转基因食品。

各人有各人的选择自由！只是选择的依据不要是谣言就行！至于做财经金融的为何要关心转基因？这个问题其实回答过无数遍了！粮食是第二大的大宗商品，而随着货币战争、能源战争之后，接下来将是粮食战争，这从中国每年必须进口上亿吨转基因粮食就可见端倪了。

非但做财经金融要关心，每个人都要关心！刚在《转基因微问答》上读到《3·15转基因打假辟谣专场》，再次辟了和转基因有关的八大谣言，特转发和大家分享。

）3·15转基因打假辟谣专场From 转基因微问答一年一度的3·15“打假日”又上线了，不知道今年又是哪些产品能够“脱颖而出”登上万众瞩目的“黑名单”大榜，小转也是和大家一样已经备好瓜准备围观了！作为给大家开开胃的前菜，小转决定先来打几个转基因的假，给大家看几个关于转基因最常见的谣言~谣言一：目前大多数食物都经过人为基因改造（错！）小转“棒打”谣言：科学家真的没有那么闲，去把各种食物挨个都去做个基因改造。

目前，全球范围内，市场上只有13种转基因作物被批准了商业化流通：苜蓿、苹果、油菜、玉米、棉花、木瓜、马铃薯、大豆、西葫芦、甜菜以及孟加拉国的Bt茄子、哥斯达黎加的转基因粉色菠萝和巴西的抗虫甘蔗。

其中中国批准商业化种植生产的只有转基因棉花和木瓜，另外转基因油菜、玉米、大豆仅允许进口用作加工原料。