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DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力2.1 待测液的制备将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。
2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。
2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。
2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。
2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。
C DPPH = mg/ml 。
（建议用0.025mg/mL ）2.2 DPPH.溶液的可见光谱以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。
A max = nm2.3 抗氧化活性测定DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。
当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。
因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强[4.5]。
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。
其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。
测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。
以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。
1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。
（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。
（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。
（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。
（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。
1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。
（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。
（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。
（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。
一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
抗氧化酶活性等测定方法叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml 水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、 5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
表征天然抗氧化剂活性的方法王会【摘要】Antioxidants can prolong the shelf life of foods containing oil or fat, and maintain their nutritional quality and flavor. Antioxidants can also regulate the oxidative damage induced by free radicals of human body, which is beneficial to human health. So it is a hot research topic to search for natural antioxidants from vegetables, fruits, herbs and other plants. The mechanism of lipid oxidation and the mechanism of the oxidation resistance action of antioxidants were discussed. Based on the mechanisms, four kinds of methods used to characterize the antioxidant activity of natural plants were reviewed.%抗氧化剂能使含有油脂或脂肪的食品保质期延长，保持其营养质量和风味；对人体内因过氧自由基引起的氧化损伤有调节作用，对人类的健康有益。
因此，从蔬菜、水果、草药等植物中寻找天然抗氧化剂并对其活性加以表征成为研究的热点。
本文在脂质氧化机理的基础上讨论了抗氧化剂的作用机理，并以此为依据总结、概括了四类用于表征天然植物抗氧化剂活性的方法。
【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2016(044)020【总页数】3页(P30-32)【关键词】抗氧化剂;抗氧化活性;表征方法【作者】王会【作者单位】河南应用技术职业学院药学与检验系，河南郑州 450042【正文语种】中文【中图分类】TS227氧化在人体和食品中的重要性已被普遍认可。
abts vc标准曲线ABTS VC标准曲线。
ABTS VC标准曲线是一种常用的生物化学实验方法，用于测定抗氧化活性。
ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）是一种常用的抗氧化剂，其氧化还原反应可以用来评估样品中的抗氧化活性。
本文将介绍ABTS VC标准曲线的制备方法和测定步骤。
首先，准备ABTS溶液。
将ABTS粉末称取至适量，加入适量的PBS缓冲液（pH=7.4），摇匀使其充分溶解，直至溶液呈现深绿色。
然后将该溶液在室温下保存，避免光照。
其次，制备过氧化氢溶液。
将过氧化氢溶液稀释至一定浓度，用于后续的实验操作。
过氧化氢是一种常用的氧化剂，可以用来促进ABTS的氧化反应。
然后，进行标准曲线的制备。
取适量的ABTS溶液，加入适量的过氧化氢溶液，使其充分反应。
随后，通过分光光度计测定不同反应时间点的吸光度值，绘制出ABTS VC标准曲线。
标准曲线的斜率和截距可以用来计算样品的抗氧化活性。
最后，进行样品的测定。
将待测样品加入ABTS溶液中，使其充分反应。
然后通过分光光度计测定样品的吸光度值，并利用标准曲线计算出样品的抗氧化活性。
通过这一方法，可以快速、准确地评估样品中的抗氧化活性，为后续的生物化学研究提供重要参考。
总之，ABTS VC标准曲线是一种常用的抗氧化活性测定方法，具有操作简便、结果可靠的特点。
通过制备标准曲线和测定样品，可以有效地评估样品中的抗氧化活性，为生物化学研究提供重要参考。
希望本文能够为相关研究工作提供一定的帮助，促进科学研究的进展。
总黄酮测定方法仪器与设备：1.恒温混匀仪BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司)2.移液枪(p1000, p200)3.分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220日本岛津）4.15×150 mm 玻璃试管5.具塞玻璃试管, 10 mL6.容量瓶, 1000, 100, 10 mL7.紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）试剂：1.硼氢化钠(成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯,≥97.0%) 避光干燥保存。
2.三氯化铝(天津博迪化工股份有限公司，AlCl3·6H2O, FW 165,分析纯，晶体, ≥99.0%)3.四氯苯醌(FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海，FW245.88≥98%,分析纯)4.乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂，FW46.07，无水乙醇, ≥99.7%,分析纯)5.四氢呋喃(THF) (广东广华科技股份有限公司，FW 72.11，≥99.0%,分析纯)6.冰乙酸(成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯)7.盐酸(成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯)8.槲皮素(国药集团化学试剂有限公司，FW302.24, ≥ 98%, 生化试剂BR)9.香兰素(天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, ≥ 99.0%,分析纯)试剂配制：1.0.3, 0.5, 1.0,2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液，溶剂为四氢呋喃：乙醇（THF:EtOH）=1:1。
配制10 mM 槲皮素标准溶液：准确称取151.12 mg槲皮素，用上述溶剂定溶至50mL容量瓶。
2.50.0 mM NaBH4乙醇溶液：称取189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解，定容100mL容量瓶。
1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。
2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。
抗氧化剂的活性分为在生物体外( 如食品中) 的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法, 不包括在生物体中测定生物活性的方法。
3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂; 在指定浓度下比较不同测试材料( 如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系) 对底物的作用。
评价或表征抗氧化活性的方法有: (1) 在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值; ( 2)测量反应的速率; ( 3) 测量诱导期( 延滞期) 或氧化达到一定程度所需的时间; ( 4) 测量速度的积分( 即动力学曲线下的面积) ; ( 5) 测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。 4. 参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND( 也叫延滞期, lag period) 常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值, 受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。
4.2抑制率( percentag e of inhibition) 和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度, 也可用EC50表示的) 常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关, 而且受其他因素的影响, 如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外, 用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下, 在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50% 抑制作用所需的时间, 也常用来表征抗氧化活性
5. 对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1) 能说明测试体系中发生的反应, 并能用明确的动力学图解描述; ( 2) 测试要有再现性; ( 3) 测试效率要足够高; ( 4) 方法要相对简单; ( 5) 能连续检测; ( 6) 应使用与体内或食品有关的活性自由基; ( 7) 分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到; ( 8) 除了适合纯溶液外, 还适合复杂生物组织和天然产物的测定; ( 9) 水溶性的和脂溶性的化合物都适用。
6. 测定抗氧化活性的方法 大多数方法涉及到直接或间接测量: ( 1) 底物或标记底物或氧消耗的衰减, ( 2) 氧化产物的生成, ( 3) 特征自由基的形成或衰减的速度或程度。在( 1) 和( 2) 中, 抗氧化活性是以对反应物的消耗或生成物的形成的程度或速率来表征抗氧化活性的; ( 3) 是假设通过捕获脂质自动氧化中的自由基抑制氧化的, 因此集中在检测被测抗氧化剂对自由基的捕获或抑制自由基的形成的能力上, 而不是检测实际发生的氧化反应, 如ABTS法和DPPH 法。
6.1以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法 脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化, 生成不稳定的氢过氧化物, 氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成, 由此可测得抗氧化活性。 由于氧化的底物、引发或加速氧化的方法以及脂质氧化检测方法的不同, 该法又可分为以下几种情况。
6.1.1氧化的底物或使用的体系 以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的测量抗氧化活性的方法经常使用。常使用纯的甘油三酸酯、植物油( 红花油、葵花油、大豆油、橄榄油等) 、鱼油或猪油作为氧化反应的底物, 也使用磷脂或脂蛋白作为底物。 为了得到重复性的结果, 选择底物时应优先考虑单一的物质, 如亚油酸或亚油酸甲酯 底物中含有的抗氧化剂( 如植物油中常含有VE) 也能参与测试过程, 干扰测定。但是实际测定中常使用植物油等脂质混合物, 因为它们是与真实食品有关的脂质成分。实际操作中应根据具体的测试方法选择合适的底物和测试体系。
6.1.2 引发或加速氧化的方法 各种加速氧化的方法, 如烘箱法、活性氧法、Rancimat 法、OSI 法。这些方法是通过升温或增加氧浓度加速氧化的。
自由基引发剂加速脂质氧化, 常用热不稳定的偶氮化合物作为引发剂, 最典型的是水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN。除此之外, 还有水溶性的ABAP、ABIP和脂溶性的ADVN、AIBN等, 也有用DBHN的 上述偶氮化合物在适当的温度下能以需要的速度分解, 生成活性自由基。由于温度容易改变和保持, 因此引发速率容易控制。上述引发剂的优点是自由基的生成速度与引发剂的浓度成比例, 与测试体系中的其他成分无关
但是, 用自由基引发剂加速反应时抗氧化剂的抗氧化能力主要体现在供氢的速度上, 没有考虑抗氧化剂自身生成的自由基的作用, 而有些抗氧化剂被氧化后的产物也能参与抑制作用, 对抗氧化活性有一定影响。
在食品体系和生物体系中还普遍使用过渡金属或过渡金属的氧化还原反应引发氧化, 如Fe2+ 和Cu2+ 、Fe3+/ 抗坏血酸等。 但是这些体系中的一些成分( 如抗坏血酸) 能与自由基反应, 干扰测定结果。而且使用含有过渡金属的体系不能将不同于初始型抗氧化剂的抑制机理( 如螯合作用) 区别开。
也有用光照或紫外光来加速氧化的, 但是光引发脂质氧化可能引起氧化机理的改变, 因此这种方法不常用。
6.1.3 脂质氧化的检测 在化学方法中, 过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量( 酸值) 、TBARS 法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值已被广泛采用。 至于物理方法, 如粘度、颜色、共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用等已用于油脂氧化的测定。此外, 不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率( C18: 2/ C16: 0) 、聚合物的含量、极性脂类的 含量也可用于检测脂质的氧化程度。 除上述方法外,测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法, 测量氧消耗的氧电极法, 测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增重等方法也常用于检测脂质的氧化。 6.1.3.1脂质氧化初期产物的检测 ( 1) 过氧化值( perox ide value, PV ) 法。 过氧化值是测量脂质氧化最常用的方法, 反映了脂质和含脂原料中氢过氧化物和脂质过氧化物的总含量。 测量PV 的方法有很多, 但其原理均系碘化氢还原
此法是根据脂质氧化生成的氢过氧化物ROOH 和过氧化物ROOR 能将碘离子氧化成碘分子进行测定的, 原理如下: ROOH + 2H+ + 2I- ---I2+ ROH + H2O ROOR + 2H+ + 2I- ---I2+ 2ROH I2+ 2S2O3 --- S4O62- + 2I2 此法灵敏度低, 选择性差。碘化氢易被氧化, 还极易与碳碳双键加成, 而且生成的碘也能与不饱和双键加成, 使测得的结果偏低。此外, 样品的量、溶剂、反应条件( 如时间、温度) 和滴定速度的不同都会造成误差。
( 2) 共轭二烯氢过氧化物法。 共轭二烯作为测量脂质氧化的一种简单的方法和有用的指标已普遍用于样品抗氧化活性的测定。共轭二烯的量可通过在某一时间的吸光值计算。此法适合纯脂质体系中脂质氧化的研究。
由于组织样品和生物体液含有许多在紫外光区有强吸收的物质( 如血红蛋白、叶绿素、嘌呤和嘧啶等) 干扰测定, 所以一般不能直接测量其共轭二烯。
这可以通过在分析前用有机溶剂将脂质提取出来加以解决。脂质中的脂肪酸在紫外区也有吸收, 对测定结果也有一定的影响。此外, 共轭二烯不稳定, 在生成的同时也会分解, 因此共轭二烯的量反映的只是氧化早期阶段脂质氧化的程度。该法不适合测量饱和脂肪酸含量高的油, 如棕榈油。 ( 3) 硫氰酸铁( ferric thiocyanate method, FTC)法。 此法是根据脂质氧化产生的过氧化物将Fe2+ 氧化成Fe3+ , Fe3+ 与硫氰酸铵反应,生成的硫氰酸铁在500 nm 处有强吸收, 通过500 nm 吸光度的变化可测得过氧化物的含量。
6.1.3.2 脂质氧化终产物的检测 脂质氧化初期产物不稳定, 可分解生成醛(如己醛) 、酮( 如丁酮、戊酮、辛酮) 、酸和烃类等小分子物质, 这些氧化的终产物也用于脂质氧化的检测,
TBARS法是目前使用最普遍的方法。但是脂质氧化形成的丙二醛并不多, 绝大多数与TBA 结合的丙二醛是在酸性条件加热时由过氧化物分解生成的。而且TBA还可以和氧化的蛋白质, 核酸等反应生成和TBA-丙二醛反应物类似的红色物质, 532~ 535nm 处的吸收包括了这些物质的贡献。用荧光法可以避免这一点。测量前, 用HPLC 分离产物也可以减少误差。脂质氧化终产物中还含有戊烷、己烷、己醛等烃类气体, 这些气体可以用气相色谱检测。通过某一小分子气体的量的变化, 可反映脂质氧化程度, 通常以己醛为检测指标。该法准确, 重复性好。
测量脂质氧化的方法很多, 以过氧化值、共轭二烯、TBARS 法和顶空气相色谱法最为常用
6.2清除自由基的方法 6.2.1ABTS 法
ABTS( 波长max= 342nm) 可被K2S2O8、MnO2、ABAP和H2O2 等各种试剂氧化, 生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS.+ 。ABTS.+ 相当稳定,在414、645、734 和805nm 处有最大吸收峰 。在有供氢能力的抗氧化剂( 如酚类物质) 存在下, ABTS.+与之反应, 变成没有颜色的ABTS。抗氧化剂清除ABTS.+ 的能力可用414 或734nm 处吸光度的变化测量。
