外源基因在大肠杆菌中的表达PPT课件

在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。 用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究
lac、tac 表达系统存在的问题
IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。
一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG
解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷 贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP CAP
lacI
葡萄糖代谢 cAMP浓度降低
高效转录
RNA RNA 聚合酶 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录
lac、tac 表达系统存在的问题
lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或
整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
基底水平转录
lacI RNA 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
高效转录
lacI RNA 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lFra Baidu bibliotekc 操纵子 转录调控的需要。
当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入
大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。
大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 转录 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 翻译
启动子
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TT GATA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
P tac = 3 P trp = 11 P lac
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。 启动子 P lac P trp -35 区序列 TTTACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T
P tac
TTGACA
TATAAT
调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。
启动子
Trp 表达系统
以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理
色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底
cAMP
cAMP CAP CAP RNA 聚合酶 Plac
基底水平转录
lacI
lacO
lacZ
lacY
lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
启动子
Lac 表达系统
以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统
转录调控机理
具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I
Lac 表达系统
正调节因子 CAP cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合