禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案

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土传真菌病害拮抗菌的筛选及其生防效果研究

土传真菌病害拮抗菌的筛选及其生防效果研究一、内容综述土传真菌病害是影响农作物产量和质量的重要因素，给农业生产带来了严重的经济损失。

传统的防治方法主要是化学农药的使用，但其存在一定的局限性，如对环境的污染、对人畜健康的潜在危害以及抗药性的产生等问题。

因此寻找一种安全、环保、高效的防治方法显得尤为重要。

近年来生物防治逐渐成为研究热点，其中拮抗菌在土传真菌病害防治中具有重要的应用价值。

本文将对土传真菌病害拮抗菌的筛选及其生防效果进行研究。

首先本文将对土传真菌病害的病原菌进行分类和鉴定，明确病害的主要病原菌种类及其特点。

然后通过文献调查和实验室实验，筛选出具有抗病作用的植物源或微生物源拮抗菌。

接着对筛选出的拮抗菌进行生物学特性的研究，包括拮抗菌对土传真菌病害的抑制作用、拮抗菌的安全性和稳定性等方面的评价。

此外本文还将探讨拮抗菌在田间应用的效果，包括拮抗菌的施用方式、用量、施用时间等因素对防治效果的影响。

通过对不同地区、不同作物类型的试验数据进行分析，总结拮抗菌的筛选规律和生防效果，为土传真菌病害的防治提供科学依据。

A. 研究背景和意义随着全球气候变化和人类活动对生态环境的影响，土传真菌病害在许多国家和地区呈现出日益严重的态势。

土传真菌病害不仅对农作物产量和质量造成严重影响，而且对人类健康和生态环境带来潜在风险。

因此研究和开发有效的拮抗菌以控制土传真菌病害具有重要的现实意义。

目前已有多种拮抗菌被广泛应用于农业生产，但由于土壤条件、作物种类和病原菌多样性等因素的影响，这些拮抗菌的防效往往不尽如人意。

因此筛选出具有良好生防效果且适应性强的拮抗菌显得尤为重要。

此外随着生物技术的发展，基因工程技术在植物病害防治领域的应用也日益广泛。

通过基因工程技术改良拮抗菌的抗性或提高其生防效果，将有助于实现对土传真菌病害的有效控制。

本研究旨在通过对不同来源的拮抗菌进行筛选，发掘具有良好生防效果的微生物资源，为农业生产提供高效、安全、环保的防治手段。

菌种筛选设计实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的本实验旨在通过设计合理的实验方案，从自然界中筛选出具有特定生理生化特性的菌种，为后续的发酵生产、生物转化等研究提供基础菌株。

二、实验原理菌种筛选是微生物学研究的重要环节，通过选择具有特定生理生化特性的菌种，可以优化发酵条件，提高发酵产物的产量和质量。

本实验采用稀释涂布平板法、平板划线法和选择性培养基等方法，对土壤样品中的微生物进行筛选。

三、实验材料1. 土壤样品：采集自某农田，样品重量约50g。

2. LB培养基：牛肉膏10g、蛋白胨5g、NaCl5g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

3. 选择性培养基：根据待筛选菌种的特点，设计合适的培养基，如淀粉培养基、糖发酵培养基等。

4. 实验仪器：无菌操作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、显微镜、移液器、无菌吸管、涂布器、玻璃棒等。

四、实验方法1. 土壤样品处理：将采集的土壤样品置于无菌容器中，加入适量的无菌生理盐水，搅拌均匀后，进行10倍梯度稀释。

2. 稀释涂布平板法：取适量稀释后的土壤样品，涂布于LB培养基平板上，倒置培养箱中，37℃培养24小时。

3. 平板划线法：取适量稀释后的土壤样品，用无菌玻璃棒在LB培养基平板上划线，37℃培养24小时。

4. 选择性培养基筛选：将筛选出的疑似菌株，接种于选择性培养基平板上，37℃培养24小时。

5. 鉴定：观察菌落特征，如菌落大小、颜色、形状等，并结合显微镜观察菌体形态，对筛选出的菌株进行初步鉴定。

五、实验结果与分析1. 稀释涂布平板法：在LB培养基平板上，观察到不同大小的菌落，说明土壤样品中存在多种微生物。

2. 平板划线法：在LB培养基平板上，观察到划线区域的菌落逐渐变稀，说明存在抑制菌。

3. 选择性培养基筛选：在选择性培养基平板上，观察到特定菌落，说明筛选出具有特定生理生化特性的菌株。

4. 鉴定：通过观察菌落特征和显微镜观察菌体形态，对筛选出的菌株进行初步鉴定，如淀粉酶产生菌、糖发酵菌等。

六、实验讨论1. 实验过程中，应注意无菌操作，避免污染。

抑制呕吐毒素生物合成的乳酸菌的筛选及鉴定

抑制呕吐毒素生物合成的乳酸菌的筛选及鉴定罗炜;宋春艳;李彦林;张蔚;鲁心怡;曹钰【摘要】以禾谷镰刀菌ACCC36938为指示菌,测定不同乳酸菌对其抑制作用,筛选得到抑菌效果较强的1株乳酸菌A14-2.进一步研究不同温度、pH值和蛋白酶处理对乳酸菌A14-2抑菌活性的影响,结果表明pH值变化对其影响最大,同时也存在非蛋白类热敏感物质具有一定抑菌作用.为了探究乳酸菌A14-2对禾谷镰刀呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)生物合成的影响,选用麦芽汁作为培养基,将乳酸菌和禾谷镰刀菌混合在麦芽汁培养基中共同培养,分析培养基中DON质量浓度变化,结果发现乳酸菌培养物及其上清液均能够在抑制禾谷镰刀菌生长的同时,也显著降低了DON的合成量,但乳酸菌细胞对DON无吸附作用.最后对乳酸菌A14-2进行理化及分子鉴定,显示其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum).【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)009【总页数】7页(P41-47)【关键词】植物乳杆菌;禾谷镰刀菌;呕吐毒素;抑菌活性【作者】罗炜;宋春艳;李彦林;张蔚;鲁心怡;曹钰【作者单位】江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122【正文语种】中文镰刀菌是谷物感染赤霉病的主要病原菌，其在适宜环境下通过侵染麦子穗部从而导致作物死亡，对农业造成巨大的经济损失[1]。

此外，镰刀菌还会产生各种真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、伏马毒素，以及多种单端孢霉烯族毒素等[2]，其中单端孢霉烯B族化合物呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)由于其易溶于水，对各类以谷物为主要原料的食品行业影响巨大，尤其是在啤酒中的大量堆积，会对人体安全产生重大威胁[3]。

一株拮抗稻瘟病菌的放线菌筛选及初步鉴定

本研究对采自全国各地的份土壤中的放线菌株进行分离筛选获得一株对稻瘟病菌具有较强拮抗作用的放线菌菌株通过形态观察培养特征生理生化特征和序列及系统发育分析等方面进行了研究初步鉴定菌株为鲜黄链霉菌材料供试茵株水稻稻瘟病菌燕麦镰孢菌小麦根腐病菌番茄灰霉病菌小麦纹枯病菌和核盘菌由黑龙江八一农垦大学农学院赠予尖孢镰刀菌菜豆丝核菌茄链格孢菌串珠镰刀菌禾谷链孢菌和茄腐镰刀病菌均由黑龙江八一农垦大学生命学院提供
文章编号：０２２９（Ｏ００ — ０５０１０ — ０Ｏ２ｌ）２０１ — ５
一
株拮抗稻瘟病菌的放线菌筛选及初步鉴定
张海霞，彦杰，冬梅，王孙葛文中
（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆１３１）６３９
第２２卷第２期江八一农垦大学学报
ＪｕｎｌｆＨｅｌｎｊｎＲａｉｒｕｔｒｌｉｅｓｔｏｒａｏｉｇｉｇｏａｙＡｇｉｌｕａＵｎｖｒｉｃｙ
２（）１～９２２：５１
Ａｐｒ２０．０１
摘要：从采自全国各地的４８份土样中分离得到放线菌４３株。以水稻稻瘟病菌为指示菌，０利用平皿对峙法筛选到３Ｏ株具有较好拮抗作用的菌株，其中菌株ＷＭ－２４的拮抗作用最强，抑菌带宽度为２．ｍ２ｍ。结合抑制菌丝生长速率法进行复筛，２结果表明菌株ＷＭ２４对稻瘟病菌的抑制效果最好， — 抑制率为８．５根据形态特征、９３％。培养特征、生理生化特征及１ＳｒＮ６Ａ序列比对Ｄ分析，初步鉴定菌株ＷＭ２４为鲜黄链霉菌（ｔｐｏｙｅｇｌｕ－Ｓｒｔｍｃｓａｂｓｏｅ关键词：稻瘟病菌；拮抗作用；筛选；鉴定

小麦赤霉病生物防治研究进展

小麦赤霉病生物防治研究进展作者：陈文华殷宪超武德亮徐剑宏赵凤春杨正友史建荣来源：《江苏农业科学》2020年第04期摘要：小麦赤霉病是造成小麦减产的重要病害之一，病原菌产生的镰刀菌毒素严重威胁食品安全。

近年来赤霉病的频繁发生和镰刀菌毒素污染超标问题日趋严重，而赤霉病抗性品种缺乏和多菌灵等化学药剂的耐药性致使现今对赤霉病控制乏力。

因此，采取包括生物防治在内的赤霉病综合防控策略成为近年来赤霉病防控的研究热点。

市场上可应用的生防制剂较少，防治效果不稳定。

本文从拮抗菌的筛选、效果评价、拮抗机制与应用策略等方面对当前小麦赤霉病的生物防治策略进行了综述，并针对现有赤霉病生物防治存在的问题提出了相应改进策略。

关键词：小麦;赤霉病;生物防治;防治机制;应用策略中图分类号： S435.121.4+5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）04-0012-07小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是由多种镰刀菌引起的真菌病害，在世界范围内均有发生[1]。

我国长江中下游地区是小麦赤霉病的高发地区，已造成了严重的经济损失[2-3]。

赤霉病不但会造成作物减产、谷物品质下降，还会降低种子的萌发率。

然而，赤霉病最大的危害是产生镰刀菌毒素，危害食品安全。

镰刀菌毒素是镰刀菌的次级代谢产物，绝大多数具有热稳定性和化学稳定性，会通过受污染的饲料流入动物体内，并且對哺乳动物的肝脏、肾脏、免疫系统和神经系统带来损伤[4]。

禾谷镰刀菌是造成小麦赤霉病的四大主要病原真菌之一[5]。

它可以产生B型单端孢霉素，例如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）及其乙酰化衍生物和玉米赤霉烯酮（ZEN）[6]。

禾谷镰刀菌主要侵染小麦、大麦和玉米等作物。

然而，近年有研究发现，从杂草、大豆等非谷物宿主中也能分离出禾谷镰刀菌[7-8]。

小麦从扬花期到蜡熟初期均有可能受到空气中孢子的侵染[9]。

其中，扬花期是最敏感阶段，尤其是在温暖潮湿的气候条件下[10]。

小麦内生细菌鉴定及其对小麦赤霉病菌的拮抗作用

治，并且辅以准确的气象预报，防治效果良好。但是施用化学药剂防治会对生态环境造成污染，
破坏自然生态平衡，因而，物防治受到了广泛生
的重视。
２１年赤霉病在湖北东部和江汉平原、０２江苏沿江和江苏南部、徽沿淮及其以南、江中北部、安浙上海有偏重流行的潜在威胁，江流域的其他麦区、长
小麦内生细菌鉴定及其对小麦赤霉病菌的拮抗作用
温辉芹，自友，裴张立生，天灵，程李雪
（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原００３）３０２
摘
要：为筛选小麦赤霉病的强拮抗菌，探索生物防治的可行性，对来自福建的小麦内生拮抗菌进行了鉴定
ｂｏｇａｃｎｒｌｆｈａＦｓｒｍｅｄｌｔｉｏｉｌｏｔｅｔｕａｉｈａｉ．ｌｃｏｏｗｕｂｇｈ
Ｋｅｒｓ：ｈａｕｏｉｍｅｄｂｉｈＦｙｗｏｄｗｅｔｓｌｕｈａｌｔ（ＨＢ）ａｔｇｎｓｃｂｃｅｉ；ｎｉａｔｒｌｆｃＦ＇ｇ：ｎａｏｉｔａｔｒａｔｃｅｉｅｔｉａｂａｅ
山西农业科学２１，０７：６ — ６０２４（）７５７７
ｄｉ０３６６ｉｎ１０－４１０２７１ｏ１．９．ｓ．２２８．１．．：９ｓ０２０８
ＪｕｎｌｆＳａｘＡｒｕｕａＳｉｃｓｏｒａｈｎｉｇｉｌｒｌｃｎｅｏｃｔｅ
变，为害有日益加重的趋势。其据全国农业技术推广服务中心分析预测，

中国不同生态地区禾谷镰刀菌种群分化及遗传多

中国不同生态地区禾谷镰刀菌种群分化及遗传多中国不同生态地区禾谷镰刀菌种群分化及遗传多禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)可侵染多种植物，特别是世界三大粮食作物小麦、玉米和水稻的许多部位引起多种病害。

禾谷镰刀菌能侵染麦类作物引起苗腐、根腐和穗腐，也能引起玉米的茎基腐和穗腐，在麦收后还能侵染水稻的穗部和稻株基部叶鞘。

禾谷镰刀菌不仅侵染作物造成产量的损失，并且侵染谷物籽粒后产生的真菌毒素对人畜健康造成严重威胁。

随着我国耕作制度的变革和全球气候变暖，禾谷镰刀菌对作物的危害也越来越大；并且近年来国际上已经将禾谷镰刀菌种下划分为9个进化群，并重新命名，而我国在这方面研究还很少。

因此，全面分析来自我国不同生态地区麦类赤霉病和玉米穗腐病的病原组成，禾谷镰刀菌种群分化、系统发育、遗传多样性和产毒类型，建立我国禾谷镰刀菌存在的进化群类型与致病力以及形态学特征的关系，可为禾谷镰刀菌侵染籽粒的毒素检测和小麦、玉米连作条件下病害综合治理奠定基础，具有重要的理论和实际意义。

本研究对河北、黑龙江和湖北等地的麦类赤霉病标样以及河北和甘肃等地的玉米穗腐病标样进行病原分离，得到镰刀菌1229株，经单孢分离纯化后，通过形态学鉴定和主要菌株的分子生物学鉴定，发现我国麦类赤霉病病穗上有禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌(F．equiseti)、串珠镰刀菌(F．verticillioides(formerly known as F．moniliforme)、胶孢镰刀菌(F．subglutinans)、层出镰刀菌(F．proliferatum)、厚垣镰刀菌(F．chlamydosporum)、黄色镰刀菌(F．culmorum)、半裸镰刀菌(F．semitectum)和锐顶镰刀菌(F．acuminatum)共9种镰刀菌；玉米穗腐病病粒上有禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、串珠镰刀菌、胶孢镰刀菌和层出镰刀菌共5种镰刀菌，其中禾谷镰刀菌为麦类赤霉病和玉米穗腐病的优势菌，禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、胶孢镰刀菌和层出镰刀菌在麦类赤霉病和玉米穗腐病的标样中均分离得到并且在所分离镰刀菌中占的比例较高，而麦类赤霉病和玉米穗腐病中其他镰刀菌的组成及分离频率在采样地区和年份间存在差异。

菌种的筛选方法及步骤(二)

菌种的筛选方法及步骤（二）引言：菌种的筛选是微生物学研究中的重要环节之一，它可以帮助科研人员确定具有理想特性和功能的微生物菌株。

本文将继续介绍关于菌种筛选的方法和步骤，以帮助读者更好地理解和应用。

概述：菌种筛选是通过一系列实验步骤来评估和选择微生物菌株的过程。

这些步骤包括初步的预筛选、进一步的生理特性和功能评估、细胞分析以及最终的筛选和鉴定。

正文内容：一、初步的预筛选1.核酸检测：使用PCR技术对菌株进行DNA提取和扩增，通过与目标靶标的比对来初步筛选具有相关基因组的菌株。

2.形态学和生理特性观察：通过显微镜观察菌株的形态特征，并进行一系列生理特性的初步评估，如生长速度、耐受性等。

二、进一步的生理特性和功能评估1.生长优势评估：在不同培养条件下比较菌株的生长速度和优势，以确定最适宜的培养条件。

2.代谢特性评估：通过测定菌株对特定有机物的降解能力和产生的代谢产物来评估其代谢特性。

3.生物活性评估：测定菌株对不同病原微生物的抑制活性，评估其潜在的生物控制能力。

4.耐受性评估：将菌株暴露在不同的胁迫条件下，如高温、低温、酸碱等，评估其对环境胁迫的耐受能力。

三、细胞分析1.细胞形态观察：通过扫描电镜和透射电镜观察菌株的细胞形态结构。

2.细胞代谢产物分析：使用色谱质谱等技术对菌株的代谢产物进行定性和定量分析，以了解其代谢能力。

四、最终的筛选和鉴定1.生物学特性分析：通过菌株的生长特性、生理学、遗传学等方面的综合分析，确定其是否具备所需的特性。

2.16SrRNA鉴定：通过比对菌株的16SrRNA序列和已知菌株的数据库，进行菌株的分类和鉴定。

总结：菌种的筛选是一个复杂的过程，需要利用多种方法和步骤来评估和选择最合适的菌株。

初步的预筛选可以帮助缩小范围，进一步的生理特性和功能评估可以深入了解菌株的能力。

细胞分析可以提供对菌株的细胞结构和代谢能力的了解，最终的筛选和鉴定可以确定菌株的分类和特性。

通过这些方法和步骤，科研人员可以获得高质量的菌株，为微生物学研究和应用提供坚实的基础。

镰刀菌

几种罹病植物镰刀菌(Fusarium)种类鉴定前言镰刀菌无性时期在分类上原属于半知菌亚门，根据《菌物词典》2001年第9版现属于无性真菌类,有性时期为子囊菌门。

镰刀菌因其在无性阶段产生的大型分生孢子形似镰刀而称之。

镰刀菌属是在1809 年Link从锦葵科植物上发现第一株镰刀菌定名为粉红镰刀菌(Fusarium roseum Link)的基础上建立起来的[1]。

镰刀菌种类多，迄今已发现44 种和7个变种[2]。

它们分布极广，在地球上所能及的地方，几乎都能找到它的踪迹。

镰刀菌历来是真菌学和植病学的主要研究对象之一。

镰刀菌对农业生产具有重要经济意义，其中的许多种是重要的植物病原菌，往往使农作物遭受重大病害，如麦类赤霉病、棉花枯萎病、水稻恶苗病、玉米青枯病、甘薯蔓割病、瓜类枯萎病等[4]，导致农业生产损失严重，甚至颗粒无收。

人类栽培的各种作物如稻、麦、棉、麻、油、茶、果树和蔬菜等，均易受到镰刀菌的侵袭而发生各种病害[4 ~ 7]。

许多重要的萎蔫病害曾在世界范围内造成许多毁灭性的植物病害。

前苏联曾有报道，当种植的甘蓝为感病品种时，镰刀菌所引起的萎蔫病害可使产量降低50%-95%。

在前苏联亚麻种植区亚麻萎蔫病发生也极为普遍，且有病的亚麻种子油是有毒的，会引起人畜中毒。

花卉植物如紫苑、石竹等等也遭受萎蔫病的损害[8]，有时危害严重到需要停止栽培的地步。

除上述病害外，镰刀菌也是根腐病和各种农作物及其他植物贮存期间腐烂病的重要病原，被污染的食品和饲料含有毒质，常使人类和家畜中毒[12]。

此外，镰刀菌可引起动物病害，如镰刀菌产生的有毒代谢产物—镰刀菌毒素（Fusariotoxin）毒性很强，污染人类食品和禽畜的饲料，会造成雏鸡、鸭、鹅、鸽子、黄牛、水牛、猪、羊、马、驴等禽畜镰刀菌毒素中毒，是常见的病害。

镰刀菌作为病原微生物也能侵入人体，引起人类的真菌病。

如茄病镰孢等镰刀菌可引致人足部溃疡、眼角膜溃疡和大骨节病等。

镰刀菌产生的毒素物质可引起人和动物的急性或非急性中毒，甚至死亡。

引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法的建立

引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法的建立王芝涵;王春伟;高海馨;荆琦;余廷濠;王燕【摘要】针对引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),根据翻译延伸因子基因(EF-1alpha)的保守区域设计特异性引物,通过优化反应时间和温度,建立一种灵敏、快速的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并对优化的F.graminearum LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及可行性检测.结果表明,该LAMP方法能够有效检测禾谷镰刀菌的基因组DNA,64℃、45 min为最优反应条件.在最佳条件下,该方法对禾谷镰刀菌具有良好的特异性,检测灵敏度可达到100 pg/μl.该检测方法为禾谷镰刀菌引起的玉米穗腐病的田间快速诊断及病原菌监测奠定了基础.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】5页(P581-585)【关键词】禾谷镰刀菌;翻译延伸因子基因;环介导等温扩增;分子检测【作者】王芝涵;王春伟;高海馨;荆琦;余廷濠;王燕【作者单位】山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学农学院,植物病理学山西省重点实验室,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S432.4+4玉米穗腐病是玉米最常见的病害之一，在中国玉米种植区普遍发生，发病率为5%～10%，感病品种的发病率高达50%，个别地块严重时可达100%[1-2]，造成了巨大的损失。

玉米穗腐病由多种病原菌侵染所致，镰刀菌为主要病原菌[3]，而且镰刀菌在致病过程中能产生多种毒素(如赤霉烯酮、单端孢霉毒素、串珠镰刀菌素和伏马菌素等)，可促使细胞凋亡，对动植物机体造成多种病理损伤，给人类的食物安全带来严重隐患[4]。

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由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。小麦赤霉病的表现小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。最常见的是穗腐。初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。小麦赤霉病的发病条件在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为 24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。气象条件对小麦赤霉病的影响较大。当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。小麦赤霉病的危害小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。 1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为%。1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达×106 hm2。2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了×106 hm2。其中仅河南省就有7年的发病面积超过×105 hm2。在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。赤霉病严重威胁小麦的安全生产，一般的流行年份可引起5%～10%的产量损失，大的流行年份可导致相当多的田块绝收。根据调查2008～2009年度全国11 个省的1018个饲料样品的毒素污染情况发现，DON毒素的检出率达%，超标率达%，其中西北地区的超标率高达%，华北和华中地区的超标率则分别为%和%[8]。本课题便是用牛肉膏蛋白胨培养基涂布平板法从小麦根际土壤中分离出细菌，纯化后用平板对峙法进行初筛和复筛。通过形态学方法、生理生化分析进行初步鉴定，研究其抗菌活性，为寻找有效抵御小麦赤霉病的方法奠定基础。

2 材料与方法供试病原菌和小麦根际土样供试植物病原真菌：禾谷镰刀菌（9435实验室保存）。小麦根际土样：河南工业大学西门大谢村麦田。试剂及仪器 2.2.1 试剂名称及生产厂家试剂名称规格生产厂家蛋白胨蔗糖牛肉浸膏 BR AR BR 北京双旋微生物培养基制品厂天津市瑞金化学品有限公司北京双旋微生物培养基制品厂可溶性淀粉 BR 天津市瑞金特化学品有限公司对二甲基氨基苯甲醛 AR 上海试剂三厂氯化钠 AR 天津市德恩化学试剂有限公司酵母膏 AR 北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉 BR 上海化学试剂厂有限公司溴百里香酚兰 AR 上海三爱思试剂有限公司葡萄糖 AR 天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠 AR 天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钾 AR 天津市化学试剂三厂柠檬酸钠 AR 湖南省医药公司化玻站硫酸镁 AR 天津市永远化学试剂开发中心乳糖无水乙醇 AR AR 天津市科密欧化学试剂有限公司天津市永大化学试剂开发中心磷酸二氢铵 AR 天津化学试剂三厂二甲苯 AR 洛阳昊华化学试剂有限公司硝酸钾 AR 天津市瑞金化学品有限公司乙酸（冰醋酸） AR 开封市芳晶化学试剂有限公司浓盐酸 AR 洛阳昊华化学试剂有限公司三氯化铁 AR 天津市化学试剂工厂碘 AR 天津市科密欧化学试剂有限公司甲基红 AR 天津市科密欧化学试剂有限公司结晶紫 AR 天津市化学试剂三厂次氯酸钠 AR 天津市光复精细化工研究所番红花红T AR 天津市科密欧化学试剂研究所 2.2.2 实验仪器仪器名称仪器型号生产公司电热恒温鼓风干燥箱 XMTD-8222 上海精宏试验设备公司高压蒸汽灭菌锅 SX-700 日本TOMY 震荡培养箱 HZQ-X100 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电热恒温培养箱 DHP-9052 上海浦东荣本科学仪器有限公司台式离心机 TDL-5A 上海菲恰尔分析仪器有限公司漩涡混合器 HQ-60-Ⅱ 北京北方同正生物技术发展有限公司无菌操作台 SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司移液枪 KHB 上海科华实验系统有限公司电子天平 JJ200 常熟市双杰测试仪器厂冰箱 BCD-155TDGA 青岛海尔股份有限公司 BCD-232MA/X1 海信容声冰箱有限公司

洁净操作台 SW-CJ-1FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司万用电炉 DL-1 北京中兴伟业仪器有限公司 pH计 DELTA 320 梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）试验方法 2.3.1 常用培养基的配制方法１、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏ｇ；蛋白胨 1ｇ；氯化钠ｇ；琼脂 2ｇ；蒸馏水100 mL； pH ～。步骤：(1) 称量：准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。牛肉膏要玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入三角瓶。也可放在称量纸上，称量后直接放入三角瓶中，按比例加水后再稍微加热，牛肉膏便会溶于水中，然后立即取出称量纸。另外称取蛋白胨时要迅速准确。 (2) 融化：可先加少许水量在电炉上加热使其溶解。药品完全溶解后，再补充水分。将琼脂加到融化的药品中，不断搅拌加热，防止琼脂糊底，烧杯破裂。最后再补充所失的水分。 (3) 调pH：先用精密纸测量培养基的pH值，一般pH偏酸，再向培养基中逐滴加入1mol/L的NaOH，一边加一边搅拌，并不停的用pH试纸测其pH值，直至pH达～。注意慢调，以避免过碱，再回调pH，否则，会影响培养基内各离子的浓度，还有可能破坏培养基的成分。如果有pH计，还可以用pH计。 (4) 分装，加塞，包装：按要求可将培养基分装于试管内或三角烧瓶内。分装时要注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，避免沾污棉塞而引起污染。固体若装于试管，则其装量不应超过管高的1/5，灭菌倾斜放置，制成斜面。三角瓶的装量不应超过容积的一半。 (5) 灭菌，无菌检查：将上述培养基以1.05 kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。灭过菌后再将培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。２、PDA培养基配方：马铃薯 100ｇ；葡萄糖 10ｇ；琼脂 10ｇ；蒸馏水 500 mL；自然pH。步骤：(1) 称量：先把马铃薯洗干净，除去皮,再称取100ｇ马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用8层纱布过滤。 (2) 溶解：可加热后再加琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补充水分至500 mL。分装、加塞、包扎、灭菌与上面的相似，如需备用，可冷存。３、LB液体培养基配方：胰蛋白胨 10ｇ；酵母提取物 5ｇ；NaCl 10ｇ；蒸馏水 1000 mL；pH：步骤：根据配方配置培养基，液体分装时不超过试管的1/4为宜，不超过三角瓶的1/2为宜，包扎灭菌等步骤与上面的相似。 2.3.2 采取土样在河南工业大学西门口的大谢村小麦地采取土样，用小铲挖取小麦根系土壤，选取５个点的小麦根系土壤，混合后备用。 2.3.3 分离土样中的细菌将采集到的麦田土壤作为内生细菌分离对象。取采集到的10ｇ土样置于装有90ml无菌水的三角瓶中，200r/min震荡30min即成10-1菌悬液，将所得的菌悬液吸取10ml置于装有90ml的无菌水三角瓶中，依次稀释成10-4、10-5、10-6，取稀释液涂布于装有牛肉膏蛋白胨培养基的平板上。4次重复，28℃培养3～4d，记录单菌落数量。根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等特征挑取不同单菌落，反复纯化后接斜面保藏。 2.3.4 筛选拮抗细菌 1、拮抗细菌的初筛用对峙培养法，取直径为8 mm的禾谷镰刀菌菌饼置于PDA培养基平板( d = 90 mm) 中央，用接种环挑取细菌菌株点接在距离平板中央30mm处，28℃培养3～5d后测量抑菌带宽度，以仅接种禾谷镰刀菌的处理为对照，每个处理重复4次。观察菌落的生长变化，根据公式计算抑制率，筛选出具有拮抗活性的菌株。抑菌率(%) = [ (对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm）) /对照菌落直径] ×100% 2、拮抗细菌的复筛对有明显抑菌效果的细菌接种于装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，三角瓶置于37℃摇床中，培养2d，将混浊的菌悬液注入无菌离心管中离心10min(5000 rpm) 可得到上清液。在无菌操作台上，抽取上清液，用细菌过滤器滤去上清液中的细菌。取200uL无菌发酵液，涂布平板，待其凉干，接病原菌菌饼，每菌种三个重复并做对照，5～7d后观察对峙效果，测量抑菌圈直径或者半径。 2.3.5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。 ① 革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。 (2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。 (3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。 (4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。 (5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。 (6) 镜检：用油镜观察。 ② 芽孢染色 (1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。