植保生物技术相应题555885858

植保生物技术第一章绪论1、生物技术（生物工程）：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他自然学科的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的技术。

2、生物技术的内容。

答：基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、酶工程第二章细胞工程第一节植物组织培养学1 植物组织培养：是指用无菌方法使植物体的离体（in vitro)器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）或试管培养。

2 几个重要的概念:愈伤组织：原本是指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。

在植物细胞组织培养中，愈伤组织则指在人工培养基上由外植体(explant)形成的一团无序生长的薄壁细胞。

外植体：由活体(in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。

脱分化：在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程，叫做脱分化。

再分化：植物的成熟细胞经历了脱分化之后，即形成愈伤组织之后，由愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程叫做再分化。

植物细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。

3 植物组织培养过程离体的植物器官、组织、细胞（脱分化）愈伤组织（再分化）根芽（）再生植株第二节培养基及培养条件1 培养基的成分及作用。

水、无机盐、有机化合物、天然提取物、琼脂、其它（PH、活性炭、抗生素、抗酚类物质污染的添加剂、生长抑制剂、染色剂）大量元素：O、H、N、C、P、K、Mg、S、Ca、N植物激素可分为如IAA 生长素和如6-BA 细胞分裂素两大类。

2 组培应如何考虑培养条件。

在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。

第三节组织培养技术及其在植保中的应用1 掌握植物离体快繁技术经历的阶段答：阶段Ⅰ：无菌培养物的建立阶段Ⅱ：茎芽的增殖阶段Ⅲ：离体形成枝条的根阶段Ⅳ：植株的移栽2 掌握花药和花粉培养、器官培养、细胞培养、原生质培养在植保上的应用花药培养——因外植体为花药，内含花粉，所以会产生单倍体、二倍体；花粉培养——因外植体为花粉—产生单倍体。

幼胚培养：原胚期——球形期——心形期——鱼雷期——子叶期成熟胚培养：子叶期后——发育完全的胚，在大量元素糖培养基上就能长成幼苗。

胚珠培养：诱发大孢子发育成单倍体；表面消毒后取胚珠，带胚座或部分子房。

试管受精、胚乳培养植物的器官培养：植物的根、茎、叶、花器和果实的无菌培养1、离体根培养2、离体茎培养3、离体叶培养4、花器官和种子培养细胞培养：材料的选择变异来源选择压力突变体分离突变体鉴定突变材料的保持和利用原生质体融合可选育具有优良性状的育种材料第四节植物无病毒苗的培育1、掌握热处理和茎尖培养脱毒的原理热处理脱毒：是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热后部分或全部钝化，不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断降低从而达到脱毒的目的。

茎尖培养脱毒：植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布，生长点(分生组织约0.1-1.0mm 区域)则几乎不含或含病毒很少。

2、掌握脱毒的方法：热处理脱毒、微茎尖培养脱毒、其他途径脱毒3、掌握脱毒苗带毒状况的检测方法：指示植物(indicating Plant)法、抗血清(antiserum)鉴定法、电子显微镜(electric microscope)检查法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、核酸斑点杂交技术(NASH) 、其它第三章分子生物学基础第一节工具酶1、概念：核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。

核糖核酸酶：专门水解RNA分子断裂的叫做核糖核酸酶（RNase）。

脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子的叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片断核酸外切酶：从核酸分子的末端开始一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链平末端（blunt end)：在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。

5’端粘性末端（cohesive end)：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。

3’端粘性末端：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。

DNA连接酶：催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA5’的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。

2、列举常用的基因工程工具酶的特性和用途？限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶修饰酶3、何为限制性核酸内切酶？限制性内切酶II有什么特征？限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。

特征：识别序列一般为4-8个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180º的旋转对称性（又称回文结构）。

II型限制酶的用途（1）DNA重组克隆及亚克隆（2）DNA杂交与序列分析（3）改建质粒（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等4、Taq DNA聚合酶的特点及用途？(1)特性：①耐热的DNA聚合酶②5’→3’聚合酶活性③5’→3’外切酶活性④最佳作用温度为72-80︒C（2）用途①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增②对DNA进行测序5、反转录酶有那些特性？（1）特性①催化从RNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）。

②具3’→5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA—DNA杂交分子中的RNA部分。

补充：1.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶）催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端2.T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链的5’末端3.碱性磷酸酶alkaline phosphatase催化核酸分子脱掉5’磷酸集团，从而使DNA、RNA片段的5’-P转变成5’-OH 末端（脱磷作用）。

第二节电泳技术1、影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素有那些？1) DNA分子的大小2) 琼脂糖浓度3) DNA分子构象4) 嵌入染料的存在5) 电源电压6) 离子强度影响2、电泳500bp大小的片段，灌制多大浓度的琼脂糖凝胶？小片段DNA(50～20 000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。

3、上样缓冲液的作用是什么？①增加样品比重，以确保样品均匀沉入加样孔内。

②使样品呈色，使加样操作更方便。

③形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。

4、水平电泳一般根据两电极之间的距离，每cm加多大的电压？5-10V第三节核酸的提取1、CTAB提取DNA的原理及各种成分的作用。

原理：CTAB（Chexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。

⏹Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；⏹EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；⏹NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；⏹CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；⏹β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

2、染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？答：碱裂解法—原理1）在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；2）将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。

通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

3、在RNA提取过程中应该注意事项？RNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。

(1)玻璃器皿:所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中180℃烘烤2小时以上。

(2)塑料容器：可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液浸泡，37℃处理12小时，然后高压灭菌，干燥备用（可在60-80℃烘干）。

(3)溶液污染：配置的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12小时以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，用经DEPC水处理过的无菌蒸馏水配置，然后用0.22µm滤膜过滤除菌(DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理Tris一类的缓冲液)。

(4）研究人员造成的污染：人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。

(5) RNA电泳槽：需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液中，室温下放置10min，然后用0.1%DEPC处理水彻底冲洗电泳槽。

有条件的话，最好留出一套玻璃器皿/塑料制品和电泳槽，作上特殊标志，存放在指定位置，为RNA实验专用。

补充：➢DNA浓度及纯度的检测A260=1 约50μg/mL➢双链DNA，A260/280 约为1.81）OD260／OD280 对DNA而言其值大约为1.8，高于1.8有RNA污染．低于1.8则有蛋白质污染。

2）OD260／OD280对RNA而言其值大约为2.0第四节基因文库•1、什么是基因文库?基因文库（gene library）:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段或cDNA,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

•2、什么是cDNA文库？cDNA文库：是指将生物某一组织细胞中的总mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适载体上转入宿主细胞后形成的所有克隆就叫cDNA文库。

第五节PCR技术1、PCR技术（原理）PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物引导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异DNA序列。