免疫学实验课件：实验二直接凝集试验

操作步骤
1、稀释血清(1:10稀释)：取EP管1支，做好标记,加入N.S 450ul，加血清50ul ,混匀备用; 2、 稀释菌液(1:4稀释):取EP管4支，分别标记好H,O,甲,乙, 加入N.S 450ul，加菌液150ul,混匀备用; 3、编号：拿一块反应板标记好一份待测标本号和操作者姓 名，于反应板的第 一排各孔标以H,O,甲,乙。 4、加样：每份标本共4排4孔。各列先分别加入100ul(2 滴)N.S从第1孔至第4孔。再加入已稀释好的待测血清 100ul(2滴)至第1孔，混匀后吸出100ul(2滴)至第2孔， 以此类推稀释至第4孔弃去100ul(2滴) 。 5、加菌液：于各排各孔中分别加入对应的1:4稀释菌液 100ul(2滴) ，此时各列每孔的血清稀释度应该依次为 1:40,1:80,1:160,1:320。 6、 轻轻混匀1min，加盖(贴上封口纸)，37℃水浴，过夜， 次日观察结果。
试剂与器材
1、标本： 待测人血清。 2、试剂： 生理盐水（NS），伤寒杆菌“H” 抗原和“O”抗原，副伤寒甲“H”抗原、副 伤寒乙“H”抗原的诊断菌液(40亿个菌/ml), 分别用N.S稀释成10亿个菌/ml 的悬液(1:4 150ul+450ulNS)。 3、器材： 恒温水浴箱、微量血凝反应板、 试管架、试管、吸管等。
结果判断
观察反应板每孔底部有无凝集物，凝集 物颗粒的大小、形状。 1、阴性结果：血清中无抗体存在，未能与菌 体产生凝集反应。因此菌体自然下沉集于 孔底成点状。 2、阳性结果：血清中有相应抗体与菌体抗原 产生凝集反应，可见凝集物均匀分别散于 孔内。
临床意义
1、正常：H＜1:160、O＜1:80，甲＜ 1:80、乙＜1:80 2、伤寒：H＞1:160、O＞1:80 3、副伤寒：H＞1:160、O＞1:80、甲＞ 1:80、乙＞1:80 4、恢复期H凝集效价成倍增高

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单向免疫扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀 39 环
抗原含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原（IgM）
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
用抗原致敏载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测
标本中是否存在与致敏载体相同的抗原。 15
以检测以尿检H测C尿GH(妊CG娠(妊试娠验试)为验例)为例
＋ 待测尿液
(含HCG)
抗HCG
特异 结合
NS
复 合 物
抗 原 抗 体
间接凝集抑制试验
致敏颗粒
无凝集颗粒
为阳性
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待测尿液
抗HCG
＋ (无HCG)
无结合 NS
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应用
1.抗体效价的滴定
以出现沉淀线的最高 抗体稀释倍数为该抗 体的效价或滴度。
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应用
2.抗原或抗体相对浓度和分子量的初步分析
二者分子量大致相等，沉淀线呈直线；分子量大扩散 慢，扩散圈小，沉淀线弯向分子量大的一方
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应用
3.抗原性质的分析
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免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
电泳技术的高分辨 率、快速、微量
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沉淀反应
液相沉淀反 应
凝胶内沉淀 反应
凝胶免疫电 泳技术
絮状沉淀试验 免疫浊度测定
单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验
对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳
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思考题
1、什么是凝集试验？什么是沉淀反应？ 2、简述直接凝集试验的定义、分类及临床应用。 3、什么是间接凝集试验？可以分为哪几种类型？

的用途和操作不同可分为免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电 泳等技术。
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试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释倍数，即为血清的沉淀
价。
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二、琼脂凝胶扩散试验
利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行反应，当抗原 抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝聚，出 现白色的沉淀线，从而判定相应的抗体和抗原。常用的凝胶
有琼脂(agar)和琼脂糖(agarose)等。
(简称凝集试验)和间接凝集试验。
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抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复 合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据是 否产生凝聚现象来判定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。 凝聚性试验是最简单的一类血清学试验。根据参与反应的抗 原性质不同，分为由颗粒性抗原参与的凝集试验和由可溶性 抗原参与的沉淀试验两大类。
(一)间接血凝试验(indirect hemagglutination test，IHAT)： 亦称被动血凝试验（passive hemagglutination assay，
PHA)，是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相 应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。如将 抗体致敏于红细胞表面，用以检测样本中相应抗原，致 敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接 血凝试验(reverse passive hemagglutinatmn assay，RPHA)。
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三、免疫电泳技术
免疫电泳技术是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技 术，在抗原抗体凝胶扩散的同时，加入电泳的电场作用，使抗体或 抗原在凝胶中的扩散移动速度加快，缩短了试验时间；同时限制了 扩散移动的方向，使集中朝电泳的方向扩散移动，增加了试验的敏 感性，因此此方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。根据试验

实验一凝集反应实验目的： 1. 掌握凝集反应的原理2. 直接凝集反应3．间接凝集反应实验内容： 1. 直接凝集反应2．间接凝集反应实验原理：当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。

一、直接凝集反应一血型鉴定人类血型是以红细胞表面所带抗原的不同而命名。

红细胞表面主要带A、B 两种抗原，人类血清中主要含有两种抗体（抗A或抗B抗体），用抗 A或抗B 标准血清可以鉴定四种不同的血型，既A、B、AB、O表型。

现介绍玻片直接凝集法。

（一）材料：人抗A和抗B标准血清、被检者红细胞、采血针、试管、载玻片、滴管、皮肤消毒剂。

（二）方法1、取清洁载玻片，用记号笔划分两半，左角上注 A字，右角上注B字2、用酒精棉球消毒指端皮肤，针刺受检者指端，取血分别滴在载玻片左右两端3、于玻片 A侧中央加抗 A型标准血清一滴，于玻片B侧中央加抗B血清一滴，充分混匀。

4、5~10min后肉眼或低倍镜观察结果，以凝集现象的有无，按下表报告结果。

血型凝集现象抗 B标准血清抗 A标准血清 O －－A －＋B ＋－AB ＋＋二、间接凝集反应将可溶性抗原吸附在惰性颗粒载体上，与其相应抗体可发生凝集，称为间接凝集反应。

本实验用猪乙型脑炎乳胶凝集实验抗体检测试剂盒进行验证试验。

（一）材料：阴性对照血清、阳性对照血清、乳胶抗原、载玻片等。

（二）方法1、取洁净载玻片，用记号笔分为两格。

2、分别取阴性对照血清和阳性对照血清于载玻片两端。

4、然后各加一滴乳胶抗原，分别混匀。

5、缓慢摇动2～5min，并观察结果。

思考讨论1、直接凝集反应与间接凝集反应的区别。

实验二免疫沉淀反应实验目的： 1. 掌握免疫沉淀反应的原理2. 琼脂糖双向免疫扩散实验内容： 1. 琼脂糖双向免疫扩散实验原理：当可溶性抗原与其相应抗体相遇，在有电解质存在的条件下，二者比例合适可出现肉眼可见的白色沉淀，故名沉淀反应。

一、琼脂糖双向免疫扩散在含有电解质的琼脂中，抗原抗体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现沉淀带。