基于PCR和位点特异性引物延伸反应的SNP检测方法的建立
单洪波1，金亚南2
（1. 杭州艾迪康医学检验中心，浙江杭州 310023；
2. 杭州优思达生物技术有限公司，浙江杭州 310053）
摘要：目的建立一种基于聚合酶链反应（PCR）、位点特异性引物延伸反应（ASE）和核酸试纸条检测技术的单核苷酸多态性（SNP）检测方法。方法先通过PCR对包含SNP位点的特异基因序列进行扩增；然后通过带有A标记的ASE引物针对SNP位点的不同基因类型进行特异性延伸；延伸后的产物可以与B标记的探针进行杂交结合，形成同时携带A和B标记的杂交产物；而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测，从而完成对SNP基因型的检测。结果通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA进行检测，PCR-ASE的检测敏感性为88 ng/反应；通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP位点2种不同基因型的检测，达到了多重检测的目的；PCR-ASE对19名志愿者的5个不同SNP位点的检测结果与基因测序法完全一致。结论PCR-ASE 是一种简单、准确的SNP基因型检测方法。
关键词：引物特异性延伸反应；单核苷酸多态性；核酸试纸条检测技术
Establishment of PCR and ASE-based detection for SNP SHAN Hongbo1，JIN Yanan2. （1. Adicon Clinical Laboratories，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2. Ustar Biotechnologies （Hangzhou） Ltd.，Hangzhou 310053，Zhejiang，China）
Abstract：Objective To establish polymerase chain reaction（PCR），allele-specific extension（ASE） and nucleic acid detection strip-based detection for single nucleotide polymorphisms（SNP）. Methods The specific gene sequence containing SNP sites was amplified by PCR. For each SNP site，ASE primers labeled with A were extended. The ASE reaction products can bind to probe labeled with B，and hybridization products containing A and B simultaneously were formed. The products can be detected by disposable amplicon cross-contamination proof device containing a nucleic acid detection strip，and the detection of SNP genotypes can be accomplished.
Results Ten-fold serial dilutions of quantified human genomic DNA were used to determine the sensitivity of PCR-ASE（88 ng/reaction）. The ability of duplex PCR-ASE with the products can be detected by a single nucleic acid detection strip. A total of 19 samples representing 5 common SNP were detected by PCR-ASE，and the results had the consistency of 100% with DNA sequencing. Conclusions PCR-ASE is simple and accurate detection for SNP.
Key words：Allele-specific extension；Single nucleotide polymorphism；Nucleic acid detection strip-based detection
文章编号：1673-8640（2018）06-0530-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.06.015
单核苷酸多态性（s i n g l e n u c l e o t i d e polymorphism，SNP）是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在2种或2种以上不同的碱基，且其中任何一种等位基因在群体中的频率不<1%。SNP是一种单碱基水平的分子遗传标记，不仅可通过连锁或关联分析来定位疾病易感基因，而且有些SNP本身就可能会导致某些疾病或引起个体对药物反应的差异[1]。同时，SNP 图谱的建立还能有效地帮助破解人类生理学密码，了解人类进化的起源以及对患者进行有效的治疗[2]。因此，SNP检测对疾病的风险性评估、诊断、预防和治疗等各方面均有很大的价值。
目前已报道了多种检测S N P的方法用于基因检测和药物基因组学的研究[1]。引物特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）是目前比较常见的
作者简介：单洪波，女，1979年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。
物（PF 和PR ）、ASE 引物和探针均购于生工生物工程（上海）有限公司；引物和探针的有关信息见表1。ASE 引物和探针的二级结构以及相互之间的杂交关系可通过Integrated DNA Technologies 公司的引物设计软件（http ：///pages/scitools ）进行分析，以避免假阳性的出现。在针对不同SNP 位点进行检测时，需设计2条PCR 外围扩增引物，其退火温度为66～76 °C ；相关的ASE 引物的5'端需标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ，FITC ）或者地高辛（digoxin ，DIG ），其退火温度为45～50 °C 。同时为了增加ASE 引物的反应特异性，可将SNP 位点设计在ASE 引物3'端的倒数第2位[11–13]。整个PCR-ASE 扩增过程在Gene Touch （PCR ）基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）上进行。Nanodrop 2000微量分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific 有限公司。PCR-ASE 产物检测所需的核酸试纸条和全封闭式靶核酸扩增物检测装置均购自杭州优思达生物技术有限公司。
一种SNP 检测技术，具体指通过设计针对不同SNP 位点基因型的特异性引物达到特异性扩增和检测的目的[3-4]。改进的AS-PCR 也包括引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应（tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction ，T-ARMS-PCR ）[5-6]和温度开关（temperature-switch polymerase chain reaction ，TSP ）等[7-8]。但目前这些方法的产物往往只能通过溶解曲线和电泳进行检测。这些检测技术不仅需要比较昂贵的仪器，还容易导致扩增产物之间的交叉污染[9-10]。鉴于SNP 检测的重要意义，本研究结合聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR ）和位点特异性引物延伸反应（allele-specific extension ，ASE ）的优点对有关SNP 位点的基因型进行检测，探讨PCR-ASE 在SNP 基因型检测方面的应用可行性。1 材料和方法1.1 材料
Taq DNA 聚合酶以及所有的外围扩增引
表1 本研究所使用的引物、探针及相关序列
引物名称基因型
序列信息（5'～3'）
长度（bp ）
P53 282PF TCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAG 23P53 282PR CTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC 23P53 282-C G/A FITC-GCTTTGAGGTG c G 13P53 282-T FITC-GCTTTGAGGTG t G 13P53 282DP TCCCAGGACAGGCA-BIOTIN 14rs 6323PF GCGATCCCTCCGACCTTGACT 21rs 6323PR CTTCTTCCAGAAGGCCTCCTTG 22rs 6323-G G/T FITC-CCCATTGGAAG g C 13rs 6323-T FITC-CCCATTGGAAG t C 13rs 6323DP AGAGAGAAACCAGTTA-BIOTIN 16rs 4532PF GGTGGGGAGGACTCCTGGA 19rs 4532PR TGTTCGTATCCTCACTGCCTGT 22rs 4532-A A/G FITC-ATTCCCTGCTT a G 13rs 4532-G FITC-ATTCCCTGCTT g G 13rs 4532DP AGTCCTCATCTTCCT-BIOTIN 15rs 6318PF GCATGAGCAACGTATTGTGTATAAG 25rs 6318PR GACGATTGAAAGTGCTGGCCAG 22rs 6318-G G/C FITC-GGTTTGGCAAT g T 13rs 6318-C FITC-GGTTTGGCAAT c T 13rs 6318DP
CGTCTGGGAATTTGA-BIOTIN
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注：PF 和PR 引物为不同位点的PCR 扩增外围引物；小写字母分别代表不同的SNP 基因型；P53 282-T 在参与多重PCR-ASE 检测时，其末端标记了DIG
