SNP突变点检测方法进展( 完整版)

TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。

PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。

PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。

当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。

特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。

两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。

根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。

整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。

尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。

RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。

尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。

技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。

它是第一代DNA分子标记技术。

Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。

已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。

RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。

1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。

但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。

所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。

从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。

SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。

一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。

依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。

因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。

这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。

生物序列数据分析中的突变检测和信号分析研究随着生物学研究的不断深入，越来越多的生物序列数据被生成并积累下来。

这些数据包含大量的信息，对于揭示生物进化、疾病机制等方面有着重要的意义。

但是，这些数据也存在着一些问题，如噪声、测序错误等，这些问题对分析结果的准确性造成了影响。

在生物序列数据分析中，突变检测和信号分析是两个重要的研究领域。

本文将分别介绍这两个方向的研究进展和方法。

一、突变检测突变是指基因组序列发生改变，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（InDel）和结构变异（SV）等。

突变检测可以帮助我们了解不同物种的进化关系、研究疾病的发生机制等。

虽然现在有很多方法可以进行突变检测，但是由于生物序列数据一般比较大，算法复杂度较高，因此如何准确、高效地检测出突变点一直是研究人员的热点问题。

在目前的研究中，主要有两种突变检测的思路：比对法和非比对法。

比对法是将待检测序列与已知参考序列进行比对，找出相应的突变点。

常用的比对工具包括BWA、Bowtie、BLAST等。

非比对法则是直接对序列进行统计和分析，不需要参考序列。

常见的非比对工具有GATK、FreeBayes、VarScan等等。

虽然比对法和非比对法各有优缺点，但是随着技术的不断革新，两种方法之间的差距正在逐渐缩小。

一些研究人员建议，根据不同的应用场景，选择合适的突变检测思路和工具进行分析。

二、信号分析信号分析是指对比较小的生物序列（如RNA测序或蛋白质质谱分析等）进行分析，从中提取相关的信号特征。

这种技术可以用于研究转录组的表达、疾病的机制等方面。

相比较于DNA序列数据，RNA或蛋白质序列数据的特点是长度较短，高度变异。

对于信号数据的处理，目前常用的方法有以下几种：1.差异表达分析差异表达分析可以帮助我们比较不同样本之间的RNA或蛋白质表达水平是否有显著差异。

这种方法的基本流程是对数据进行预处理，如对序列进行去除低质量序列、去除适配体等质量控制步骤，然后利用一些统计学方法（如DESeq2、edgeR）计算不同表达水平的基因或蛋白质。

SNP检测(中文)Part I：样本基因组DNA的提取1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。

冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。

重复洗2次。

2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。

3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。

4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。

5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。

6.用等体积的氯仿再抽提一次。

7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。

8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。

9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。

冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。

10.沉淀于100 μl超纯水中。

11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。

Part II：SNP分型检测1.引物的设计与合成(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成2.PCR扩增片段(1)PCR扩增体系：Components Volume (μl)DNA template1PrimeSTAR0.5dNTPs (2.5 mM)1Primer-F (10 μM)1Primer-R (10 μM)15*PS buffer(Mg2+)10ddH2O1(2)PCR扩增程序：(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。

SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记:分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。

现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。

即使想要验证已经定位的QTLs,我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。

1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单,高通量。

可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。

在国家玉米改良中心，有一套3k 的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs 初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。

在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。

目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7，720条探针.而Affymetrix 公司目前并没有相应的产品.但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。

番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为～2，500Mb，但是他们包括的基因数目~30，000个，整体情况相近。

另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低.因此,综合考虑，我建议我们可以开发～3k芯片,应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。

虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。

总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面,芯片有其很高的应用价值。

即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。

1.2全基因组SNP—Douglas:当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs 或是基因,我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型,而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。

SNP与疾病的关联研究摘要：SNP作为一门新兴技术，一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是300万个。

SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。

SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。

SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。

关键词：SNP 疾病脑出血冠心病正文：激肽释放酶基因多态性与人群脑出血的关联研究流行病学研究表明高血压患者尿液中激肽释放酶的活性与其血压水平呈负相关，提示KLK1基因可能在血压的调节中起到一定的作用；在人类疾病研究领域，有研究表明KLK1基因遗传变异与血管重构相关，同时发现了激肽释放酶基因启动子及编码区多态性与人类原发性高血压的发生有关。

KLK1基因位于染色体19q3.2-q13.4,全长包括5个外显子和4个内含子。

其编码蛋白KLK1是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布在心血管系统。

肾脏及中枢神经系统中，以旁分泌形式发挥其生物学作用。

在心血管系统中，组织型激肽释放酶被分泌到细胞外，并迅速转化为活性激肽释放酶，作用于其底物激肽原释放缓激肽，缓激肽与受体结合后可调节一系列具有生物活性介质的释放，如一氧化氮，前列腺素和血小板活化因子等，从而会发扩张血管，调节血流等多种生物学效应，参与平滑肌收缩，细胞增殖，血管重构等多种生理和病理生理过程。

通过手机273例散发性脑出血患者和140名正常对照着的外周血标本。

采用多重单碱基延伸SNP分型技术和DNA测序来检测KLK1基因rs5516及rs5517多态性位点在2组人群中的分布。

基因组学中的突变检测方法综述引言：基因组学是研究基因组结构和功能的学科，突变是基因组中发生的任何改变，包括单个核苷酸改变、插入、缺失、倒位等。

随着高通量测序技术的发展，突变检测变得更加容易和准确。

本文将综述基因组学中常用的突变检测方法，包括SNP检测、结构变异检测、CNV检测以及突变的功能预测。

一、SNP检测方法：单核苷酸多态性（SNP）是基因组常见的变异形式，其在人类遗传疾病和个体间遗传差异中起着重要作用。

常用的SNP检测方法包括PCR-RFLP、TaqMan探针、KASP和SNP芯片等。

PCR-RFLP方法通过PCR扩增目标基因片段并使用限制性内切酶识别酶切位点是否发生改变来检测SNP。

TaqMan探针方法利用荧光探针结合靶标序列进行SNP检测。

KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）是一种高通量的SNP分析方法，结合了多重PCR和高解析度熔解曲线分析。

SNP芯片则是一种高通量的平行检测技术，可以同时检测大规模的SNP。

二、结构变异检测方法：结构变异（SV）是指不同于单个核苷酸变异的大片段DNA片段的插入、缺失、倒位等。

常用的结构变异检测方法包括比较基因组杂交（CGH）阵列、分析转录本剪接和单分子测序。

CGH阵列利用比较基因组学的方法来检测基因组中的结构变异。

分析转录本剪接则通过检测mRNA的剪接形式来检测结构变异。

单分子测序是一种新兴的测序技术，可以直接读取长的DNA分子序列信息，对结构变异具有较高的敏感性和准确性。

三、CNV检测方法：拷贝数变异（CNV）是指基因组中一段较大的DNA片段的拷贝数发生变化。

常用的CNV检测方法包括CGH阵列、定量PCR、下一代测序和单分子测序等。

CGH阵列可以同时检测大量的CNV，而定量PCR方法通过在不同拷贝数下检测目标基因的拷贝数来检测CNV。

下一代测序和单分子测序可以通过深度测序来检测基因组中的CNV。

四、突变的功能预测方法：突变的功能预测是指通过计算方法和数据库筛选，预测突变对蛋白质结构和功能的影响。

SNP操作步骤与结果记录按照陈丽学位论文第二部——步骤一、使用在线软件SHEsis检验各个危险的hw遗传平衡（因rs2607659未发生突变，故不纳入分析。

）结论：9个位点P值均大于0.05，均符合HW遗传平衡。

（有附件）步骤二、分析前将协变量进行分类，并用KS法检验连续变量正态性，结果如下：正态性连续变量非正态连续变量分类变量ALT CR eGFR-AAST BMI HBeAg年龄 eGFR 年龄-A药物浓度 ADV合用性别步骤三、用KM生存曲线画出某一位点的CK升高时间与累积危险函数之间的曲线，（KM曲线中状态选项选择服药四年CK数据组）并联合Log-rank检验，比较该位点突变与否对CK 结局的差异。

结果：9个位点P值均大于0.05即：这些位点的变异对CK升高作用无差异。

为验证统计操作的正确性，将TK2基因rs3826160位点进行统计，得到的KM曲线与Log-rank P 值与陈丽师姐论文相同。

故统计操作正确。

（SPSS输出结果见附件）步骤四、对协变量进行单因素分析，排除rs位点突变与其他临床因素对CK产生相反作用，掩盖rs位点对CK结局影响的情况。

选择二元Logistic回归（除根据P值定性外，可提供OR值观察因素的影响程度）方法。

影响CK的临床因素(P<0.05)如下：协变量 P性别 0.000药物浓度 0.007年龄 0.032BMI 0.016HBVDNA-A 0.021CR 0.01eGFR 0.03（SPSS输出结果见附件）因HBVDNA数据只有91个，数据不足，使统计结果不佳。

同时有多篇文献得出HBVDNA与CK （CHB,LDT）升高无相关性。

故不纳入多因素分析。

步骤五、将有意义的单因素用COX回归模型纳入多因素分析，结果9个位点的P值均无意义。

为验证统计方法的正确性，将TK2基因rs3826160位点进行统计，得到性别和rs3826160多态性是CK升高的独立影响因素，其中分层分析中，男性患者出现CK升高的风险高于女性。