第23卷第2期2024年3月杭州师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f H a n g z h o uN o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )V o l .23N o .2M a r .2024收稿日期:2023-05-25 修回日期:2023-06-07基金项目:浙江省自然科学基金项目(L Q 20B 060003);杭州师范大学科研启动经费项目(2018Q D L 040).通信作者:汪红娣(1989 ),女,讲师,博士,主要从事靶向纳米药物的设计和控缓释研究.E -m a i l :w a n g .h o n gd i @h z n u .e d u .c n D O I :10.19926/j.c n k i .i s s n .1674-232X.2023.05.251文献引用:朱曙霞,王美玲,许紫宁,等.基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究[J ].杭州师范大学学报(自然科学版),2024,23(2):113-123.Z HU S h u x i a ,WA N G M e i l i n g ,X UZ i n i n g ,e t a l .S t u d y o n c o l o n -t a r ge t e d o r a l n a n o m e d i c i n e b a s e d o nZ e i n -H Ac a r r i e r [J ].J o u r n a l o fH a n g z h o uN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n ),2024,23(2):113-123.基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究朱曙霞,王美玲,许紫宁,庾远龙,潘建林,汪红娣(杭州师范大学材料与化学化工学院,浙江杭州311121)摘 要:设计基于玉米醇溶蛋白(Z e i n )-透明质酸(HA )的口服纳米载体用于结肠靶向的药物递送.使用超声透析法制备玉米醇溶蛋白-透明质酸-羟基喜树碱(H C P T )纳米药物(Z e i n -HA@H C P T ),利用渴望函数分析法优化纳米药物制备条件,考察纳米药物的微结构㊁药物释放行为㊁细胞毒性和靶向摄取能力.Z e i n -HA@H C P T具有95%以上的药物包封率,有优异的生物学稳定性㊁生物相容性和独特的抗胃酸分解特性,结肠环境下的药物累积释放显著提升.Z e i n -HA@H C P T 通过C D 44受体介导的内吞作用被结肠癌细胞靶向摄取,可提高药物抗肿瘤疗效.关键词:玉米醇溶蛋白;透明质酸;羟基喜树碱;结肠靶向中图分类号:T Q 46 文献标志码:A 文章编号:1674-232X (2024)02-0113-11结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,具有早期症状不明显㊁死亡率高㊁易复发等特点[1-2].抗癌口服药物制剂由于不受时空限制,易被患者接受和使用,具有极大的市场潜力[3].目前,因溶解度低㊁渗透性差或口服生物利用度低等原因,上市的化疗药物的相关产品多为静脉注射给药药物,如羟基喜树碱[4]㊁盐酸阿霉素[5]㊁紫杉醇[6]㊁吉西他滨[7]等.相较于注射给药,口服给药需考虑避免胃肠道p H ㊁消化酶和黏膜等多重生理屏障对药物活性和吸收率的影响[8],这就要求口服药物应具有良好的稳定性.此外,难溶或低渗类药物的溶解度低且不易跨过小肠上皮细胞膜,其口服制剂的开发最具挑战[9].将药物活性成分与合适载体材料结合,制备药物递送系统(d r u g d e l i v e r y s y s t e m ,D D S )是解决口服给药难题的重要技术手段.D D S 中的药物通常以分子态或无定形态存在,使药物溶解度显著提高.同时,D D S 中载体材料的合理选用可实现药物的跨膜递送㊁主动靶向和控缓释,从而提高治疗效果和安全性.玉米醇溶蛋白(Z e i n)具有独特的自组装特性㊁良好的抗胃酸分解特性和生物相容性,被广泛用作药物载体材料.但由于较强的疏水特性和缺乏靶向性,限制了玉米醇溶蛋白在纳米药物精准递送领域的应用[10].透明质酸(h ya l u r o n i ca c i d ,H A )是一种天然多糖,具有良好的亲水性,可被肿瘤细胞中过表达的411杭州师范大学学报(自然科学版)2024年C D44受体特异性识别[11].本研究利用超声透析法制备了具有独特抗胃酸分解特性和主动靶向能力的Z e i n-H A基纳米载体.结合超声乳化和透析技术的超声透析法(图1A),可有效避免Z e i n-H A纳米颗粒的聚集,提高产品分散性,同时可有效控制过程参数(如温度㊁溶剂㊁载材浓度㊁超声条件),调控玉米醇溶蛋白的自组装,获得高产品收率的纳米颗粒.在此基础上,利用纳米载体与羟基喜树碱(H C P T)之间的亲疏水作用,采用一步法获得高效封装的玉米醇溶蛋白-透明质酸基纳米药物,探究Z e i n-H A@H C P T的理化性质(形貌㊁化学结构㊁载药能力)㊁模拟胃肠道环境药物释放能力(图1B)和生化性质(生物稳定性㊁细胞毒性㊁靶向摄取能力等).A:超声透析法制备Z e i n-HA基纳米颗粒;B:口服纳米颗粒的胃肠道环境,依次经过胃酸环境(p H=1.2)㊁小肠流体(p H=7.4)和结肠流体(p H=6.0).图1玉米醇溶蛋白-透明质酸基纳米药物制备及递送F i g.1P r e p a r a t i o na n dd e l i v e r y r o u t e o fZ e i n-H Ab a s e dn a n o m e d i c i n e1材料与方法1.1主要试剂和仪器玉米醇溶蛋白购自美国S i g m a-A l d r i c h公司,透明质酸购自西安百川生物科技有限公司,D M E M细胞培养基㊁青霉素-链霉素购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司,胰蛋白酶购自浙江吉诺生物医药技术有限公司,胎牛血清购自依科赛生物科技(太仓)有限公司,其余试剂(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司.S U P R A T M55扫描电子显微镜㊁L S M710激光共聚焦显微镜㊁37081正置荧光显微镜均购自德国Z e i s s公司,H i t a c h iH T-7700透射电子显微镜购自日本日立公司,Z e t a s i z e rN a n oS90马尔文粒度仪购自德国M a l v e r n公司,D8A D V A N C EX射线衍射仪购自德国B r u h k e r公司,N i c o l e t i S50傅里叶变换红外光谱仪购自美国T h e r m oF i s h e r S c i e n t i f i c公司,S C I E N T Z-ⅡD超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司,L a m b d a750紫外分光光度计购自美国P e r k i n E l m e r公司,i M a r k1681130酶标仪购自美国B i o-R a d公司.1.2玉米醇溶蛋白-透明质酸纳米颗粒的合成玉米醇溶蛋白-透明质酸纳米颗粒(Z e i n-H A)使用超声透析的方法进行制备.超声透析技术装置主要包括超声细胞粉碎机㊁透析袋㊁夹套烧杯㊁恒温槽和隔音箱,如图1A所示.将2m g的H A溶于3m L的超纯水中,超声使H A充分溶解.随后,在此溶液中加入7m L无水乙醇和10m g玉米醇溶蛋白,充分混合溶解.将上述溶液置于透析袋中,悬挂于超声波细胞粉碎机中,设定超声功率为150W,o n/o f f=2s/2s, 20ħ反应20m i n.通过梯度离心(3000r/m i n5m i n,8000r/m i n10m i n,3次)收集Z e i n-H A.将收集得到的Z e i n -H A 进行冷冻干燥,获得淡黄色样品.1.3 羟基喜树碱的包载利用羟基喜树碱(H C P T )与Z e i n -HA 之间的亲疏水作用,制备Z e i n -H A@H C P T.将2m g 的H A 溶于3m L 的超纯水中,加入7m L 无水乙醇㊁10m g 玉米醇溶蛋白和3m g H C P T.将上述溶液置于透析袋中,悬挂于超声波细胞粉碎机中,以150W 的功率,o n /o f f =2s /2s ,20ħ反应20m i n ,制备得到Z e i n -H A@H C P T.1.4 载药前后纳米颗粒的储存稳定性测试将新鲜制备的Z e i n -H A 和Z e i n -H A@H C P T 纳米颗粒分别置于p H7.4的磷酸盐缓冲溶液(P B S )中重悬,分别在第1天㊁第3天㊁第7天㊁第14天时取出部分样品,使用动态光散射仪(D L S )测定粒径㊁粒度分布指数(p o l y d i s p e r s i t yi n d e x ,P D I )和Z e t a 电位.1.5 纳米颗粒的形貌表征使用扫描电子显微镜(S E M )在15k V 的加速电压下,观察纳米颗粒的表面形貌结构和粒径大小.使用透射电子显微镜(T E M )在亮场模式㊁100k V 的加速电压下,观察纳米颗粒的内部形貌特征.1.6 载药前后纳米颗粒的粒径和Z e t a 电位表征将Z e i n -HA 和Z e i n -H A@H C P T 离心重悬后分散于超纯水中,使用D L S 测定载药前后纳米颗粒的粒径㊁P D I 和Z e t a 电位.1.7 纳米颗粒的化学结构与晶型结构分析使用傅里叶红外光谱仪(F T I R )分析不同纳米颗粒的化学结构,设置扫描范围为4000c m -1~500c m -1.使用X 射线衍射仪(X R D )分析不同样品的晶型结构,设定仪器参数:在40m A 和40k V 下产生C u -K α辐射,扫描速度为10ʎ/m i n ,扫描范围为5ʎ~80ʎ.1.8 Z e i n -H A @H C P T 的载药量和包封率表征图2 H C P T 的标准曲线F i g.2 S t a n d a r d c u r v e o fH C P T 在Z e i n -HA@H C P T 中加入二甲基亚砜(D M S O ),超声使药物溶出,离心后取上清液.使用紫外分光光度计测定384n m 处H C P T 的吸光度,根据图2的标准曲线计算上清液中H C P T 的质量浓度.分别计算纳米颗粒的包封率E 和载药量L ,计算公式为E =m (被封装的H C P T )m (总H C P T )ˑ100%,(1)L =m (被封装的H C P T )m (总纳米颗粒)ˑ100%.(2)1.9 Z e i n -H A @H C P T 的体外释放药物实验准确称取5m g Ze i n -HA@H C P T 分散于透析袋中,置于透析液为模拟胃液的烧杯中,透析2h .2h 后将透析袋取出,置于透析液为模拟小肠液的烧杯中,继续透析4h .最后置于透析液为模拟结肠液的烧杯中,透析18h .每隔一段时间,在透析液中取出2m L 液体,采用紫外分光光度计测定吸光度,同时补充2m L 相应的透析液.根据图2标准曲线,确定Z e i n -H A@H C P T 的体外累积药物释放百分比.1.10 细胞培养在37ħ㊁含5%C O 2的湿润条件培养基中培养小鼠结直肠癌细胞(C T 26,C D 44受体高度表达).条件培养基为含有10%胎牛血清和1%抗生素(100U /m L 青霉素和100μg/m L 链霉素)的D M E M 培养基.1.11 纳米颗粒的细胞毒性实验通过C C K -8比色法确定H C P T ㊁Z e i n -H A 和Z e i n -H A@H C P T 对C T 26细胞生长的影响.将C T 26细胞接种在96孔板中(每孔5ˑ103个细胞),给予条件培养基贴壁培养24h .用不同质量浓度(H C P T 等511 第2期朱曙霞,等:基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究同质量浓度0㊁0.001㊁0.01㊁0.125㊁0.25㊁0.50㊁1㊁2.5㊁5㊁10μg/m L )的上述纳米颗粒分别处理细胞.培养24h 后,加入10μLC C K -8,继续在37ħ㊁5%C O 2的潮湿环境中孵育1h .用酶标仪读取450n m 下的吸光度值.1.12 纳米颗粒的细胞摄取实验和H A 竞争实验将C T 26细胞接种在6孔板中(每孔1.5ˑ106个细胞),孵育24h .分别给予0.5μg /m L H C P T 或Z e i n -H A@H C P T (H C P T 等同质量浓度为0.5μg/m L )孵育4h .随后,用细胞核染料D A P I 染色,P B S 清洗后封片.使用正置荧光显微镜观察细胞摄取情况.将C T 26细胞与游离0.50m g /m L HA 预处理1h 后,更换新鲜培养基.加入0.5μg/m L H C P T 或Z e i n -H A@H C P T (H C P T 等同质量浓度为0.5μg/m L ),与细胞共同孵育4h .去除培养基后,用D A P I 染色,使用正置荧光显微镜观察竞争实验结果.2 结果与讨论2.1 不同因素对Z e i n -H A 粒径㊁P D I 和Z e t a 电位的影响使用正交试验设计O A 16(44)探索不同实验条件对Z e i n -H A 尺寸的影响,并优化超声透析制备Z e i n -H A 纳米颗粒的操作参数.如表1所示,实验设置了4个因素,即玉米醇溶蛋白质量浓度㊁H A 分子量㊁反应温度和超声功率.每个因素的水平范围基于预实验结果确定,通过超声透析制备的Z e i n -H A 的粒径范围为201.5~2299.3n m.表1 O A 16(44)的正交实验结果T a b .1 R e s u l t s o f t h eO A 16(44)m a t r i x o f o p e r a t i n g co n d i t i o n s 实验序号Z e i n质量浓度/(m g /m L )HA分子量/k D a 反应温度/ħ超声功率/WZ e t a 电位/m V粒径/n m 粒度分布指数渴望函数指数S E M 对应图序号11.010020100-21.0ʃ0.8201.5ʃ0.20.2040.903图3a 21.040030125-8.7ʃ1.2265.5ʃ0.10.1180.99631.010*******-24.8ʃ2.0243.8ʃ0.30.2340.862图3b 41.0150050175-14.2ʃ0.6373.6ʃ0.20.1770.926图3c52.510030150-55.4ʃ0.7405.5ʃ0.30.1460.61162.540020175-46.7ʃ1.3432.9ʃ0.30.2740.663图3d 72.5100050100-57.3ʃ0.8430.7ʃ0.20.2240.56582.5150040125-58.8ʃ0.1573.2ʃ0.10.2380.526图3e 95.010040175-49.5ʃ0.31120.3ʃ0.60.1980.566105.040050150-44.1ʃ0.7844.2ʃ0.40.1800.659图3f115.010*******-43.0ʃ0.61190.7ʃ0.30.4560.526图3g125.0150030100-46.7ʃ1.1573.5ʃ0.40.4380.589137.510050125-71.5ʃ1.41216.4ʃ0.40.9460147.540040100-49.7ʃ0.3734.2ʃ0.70.4490.542157.5100030175-39.5ʃ0.72299.3ʃ0.50.1850图3h 167.5150020150-41.5ʃ0.21219.0ʃ0.60.3150.576图3i最优条件1.040020150-36.4ʃ0.6344.9ʃ0.30.248不同实验组制备得到的典型Z e i n -H A 的扫描电子显微镜图见图3.当Z e i n 质量浓度为1.0m g/m L 时,能得到粒径较小但团聚交联明显的胶束状颗粒;当Z e i n 质量浓度为2.5m g /m L 时,Z e i n -HA 的交联情况得到一定改善;随着Z e i n 质量浓度进一步提高至5.0m g /m L 时,Z e i n -H A 表现为均一且分散性较好的球形形态;当Z e i n 质量浓度为7.5m g/m L 时,Z e i n -H A 的形貌虽呈球形形态,但粒径较大(2μm ).因此,通过调节操作参数,可获得均匀粒度和良好球形形貌的Z e i n -H A.611杭州师范大学学报(自然科学版)2024年a i 分别对应实验序号1,3,4,6,8,10,11,15和16.图3 Z e i n -H A 纳米颗粒的扫描电子显微镜图F i g .3 S E Mi m a g e s o fZ e i n -H An a n o pa r t i c l e s 采用单因素分析法和渴望函数分析法对正交实验结果进行分析,综合考虑对产品性能影响较大的各评价指标,获取最佳操作条件,如表2所示.根据渴望函数分析法结果,得到不同因素对纳米颗粒表型的重要性顺序为Z e i n 质量浓度>H A 分子量>超声功率>反应温度.根据k i 值,确定使用超声透析法制备Z e i n -H A 纳米颗粒的最佳参数水平:Z e i n 质量浓度为1.0m g/m L ㊁H A 分子量为400k D a ㊁反应温度为20ħ㊁超声功率为150W.使用最优参数条件制备的Z e i n -H A 纳米颗粒的粒径为344.9n m ,在正交表的粒径数据范围内.表2 不同评价指标的极差分析结果T a b .2 R a n g e a n a l ys i s r e s u l t s f o r e v a l u a t i o n i n d i c a t o r s 影响因素Z e i n 质量浓度HA 分子量反应温度超声功率 粒径 k 1271.1735.9761.0485.0 k 2460.6569.2886.0811.4 k 3932.21041.1667.9678.1k 41367.2684.8716.21056.5 R 4384.51887.7872.22286.2 Z e t a 电位 k 1-17.2-49.4-38.0-43.7 k 2-54.5-37.3-37.6-45.5 k 3-45.8-41.1-45.7-41.5 k 4-50.6-40.3-46.8-37.5 R149.448.436.732.1 粒度分布指数 k 10.1830.3740.3120.329 k 20.2210.2550.2210.440 k 30.3180.2750.2800.219711 第2期朱曙霞,等:基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究811杭州师范大学学报(自然科学版)2024年表2(续)影响因素Z e i n质量浓度HA分子量反应温度超声功率k40.4740.2920.3820.209R1.1630.4730.6420.924渴望函数指数k10.9220.5200.6670.650k20.5910.7150.5490.512k30.5850.4880.6240.677k40.2800.6540.5370.539R2.5690.9090.5180.660在最优条件下制备得到的Z e i n-H A的扫描电子显微镜图和动态光散射仪图如图4所示,结果表明通过超声透析法获得的Z e i n-H A纳米颗粒尺寸较小且分布较窄.a:扫描电子显微镜图;b:动态光散射仪图;D p50:中值粒径;P D I:粒径分布指数.图4使用最优条件制备的Z e i n-H A的扫描电子显微镜和动态光散射仪图F i g.4S E Mi m a g e a n dD L S r e s u l t s o fZ e i n-H A p r e p a r e du n d e r t h e o p t i m a l c o n d i t i o n2.2Z e i n-H A的药物负载与理化性质2.2.1Z e i n-H A@H C P T的形貌与化学结构使用超声透析法一步制备得到Z e i n-H A@H C P T.如图5所示,制备得到的Z e i n-H A@H C P T纳米药物为表面光滑的球形颗粒,粒径比Z e i n-H A增加了约30n m,平均粒径为383.5n m.a:扫描电子显微镜图;b:动态光散射仪图;D p50:中值粒径;P D I:粒径分布指数.图5Z e i n-H A@H C P T的扫描电子显微镜和动态光散射仪图F i g.5S E Mi m a g e a n dD L S r e s u l t s o fZ e i n-H A@H C P T使用傅里叶红外光谱仪研究了不同纳米颗粒的化学结构成分.如图6所示,H C P T在1740c m-1处表现出内酯环结构中酯键的红外特征峰[12].与Z e i n-HA的红外光谱相比,Z e i n-H A@H C P T具有1740c m-1处的H C P T特征峰,表明H C P T被成功包封在Z e i n-H A中.图6 H C P T ㊁Z e i n -H A @H C P T ㊁Z e i n -H A 和Z e i n 的傅里叶红外光谱仪图F i g .6 F T I Rs pe c t r a o fH C P T ,Z e i n -H A @H C P T ,Z e i n -H Aa n dZ e i n图7 H C P T ㊁Z e i n -H A @H C P T 和Z e i n -H A 的紫外分光光度计图F i g .7 U V -v i s s p e c t r a o fH C P T ,Z e i n -H A @H C P Ta n dZ e i n -H A 为进一步确保药物被封装在Z e i n -HA 中,对载药前后的纳米颗粒进行紫外分光光度计分析.如图7所示,游离H C P T 的紫外吸收峰为384n m ,Z e i n -H A@H C P T 中可以清晰地观察到该特征峰,而Z e i n -H A 中没有紫外特征吸收峰.实验结果表明,H C P T 被有效地包封在Z e i n -HA 中.2.2.2 Z e i n -H A@H C P T 的载药量和包封率H C P T 通过疏水作用被装载到Z e i n -HA 纳米颗粒中.使用D M S O 使纳米颗粒溶出并释放包封药物,测定溶出上清液中的H C P T 质量浓度,计算得到Z e i n -H A@H C P T 的包封率为95.85%,载药量为7.98%.结果表明,Z e i n -H A@H C P T 具有较高的包封率,可能是由于HA 的交联网状结构在一定程度上提高了纳米颗粒的包封率,或者H A 分子可以通过氢键作用将生物活性分子包封[13].图8 H C P T ㊁Z e i n -H A @H C P T ㊁Z e i n -H A 和Z e i n 的X 射线衍射图F i g.8 X R Dc u r v e s o fH C P T ,Z e i n -H A @H C P T ,Z e i n -H Aa n dZ e i n 2.3 不同纳米颗粒的晶型分析通过X 射线衍射仪表征,发现H C P T 原料药具有尖锐的晶型峰.当H C P T 原料药被封装在Z e i n -H A 中时,尖锐的晶型峰消失了,如图8所示,表明当封装在Z e i n -H A 中时,H C P T 以无定形的形式存在,这有助于提高H C P T 的溶解度和生物利用度[14].2.4 模拟胃肠道液的体外释药研究口服药物在胃肠道中的累积释放情况是评估药物疗效的重要指标.本研究根据药物口服后在各消化部位的停留时间,模拟观察了纳米药物在胃肠道消化液中911 第2期朱曙霞,等:基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究021杭州师范大学学报(自然科学版)2024年H C P T的释放情况.如图9所示,游离H C P T在前30分钟表现出明显的药物突释现象,随着时间的增加, H C P T的释放速率显著降低,这主要由于晶型态的H C P T原药在水溶液中的溶解度很低,H C P T原药快速达到了溶解平衡.Z e i n-H A@H C P T在胃液(S G F)中的释放量(小于10%)显著低于H C P T原药(约30%),这得益于Z e i n载体优异的抗胃酸分解特性.Z e i n-H A@H C P T在结肠液(S C F)环境下,表现出显著的药物释放(约60%),表明Z e i n-H A@H C P T具备优异的结肠靶向性,主要原因可能是Z e i n载体的控缓释作用和p H响应的Z e i n载体的溶胀行为.据文献[15-16]报道,结肠中的肠道微生物能有效降解Z e i n基载体,有助于目标药物在结肠病灶部位的靶向释放.图9H C P T和Z e i n-H A@H C P T在模拟胃肠道消化液中的体外释药曲线F i g.9I nv i t r od r u g r e l e a s e c u r v e o fH C P Ta n dZ e i n-H A@H C P T i n s i m u l a t e d g a s t r o i n t e s t i n a l f l u i d s分别取出部分在胃液(S G F)消化后㊁小肠液(S I F)消化后和结肠液(S C F)消化后的Z e i n-H A@ H C P T,使用扫描电子显微镜观察其表面形貌的变化.如图10所示,未经消化的Z e i n-H A@H C P T呈光滑的球形且粒径均一;经S G F消化后,其形貌和粒径未发生明显变化;经S I F消化后,Z e i n-H A@H C P T的表面形貌发生了轻微变化,其表面出现部分溶胀粘连,由立体球形转变为扁平球形;经S C F消化后,Z e i n-H A@H C P T失去完整的球形,呈现大片黏连,这可能是由于S C F使Z e i n-H A载体发生明显溶胀,从而释放H C P T,造成了Z e i n-H A@H C P T形态的改变.R a w:原始样品;S G F:模拟胃液流体;S I F:模拟小肠流体;S C F:模拟结肠流体.图10不同胃肠道液环境下Z e i n-H A@H C P T的扫描电子显微镜图F i g.10S E Mi m a g e s o fZ e i n-H A@H C P Ta f t e r t r e a t m e n tw i t hSG F,S I Fa n dS C F2.5 Z e i n -H A @H C P T 的生物稳定性生物稳定性是评估纳米颗粒在生物体内利用效率的关键因素.本研究对制备得到的Z e i n -H A@H C P T 进行了储存稳定性测试.将制备得到的Z e i n -H A@H C P T 置于p H 7.4的P B S 中,使用动态光散射仪测定粒径㊁粒度分布指数和Z e t a 电位在14d 内的变化.如表3所示,2周内,Z e i n -H A@H C P T 的粒径㊁粒度分布指数和Z e t a 电位均无显著变化,表明Z e i n -H A@H C P T 具有良好的生物稳定性.表3 P B S 缓冲液(pH 7.4)中Z e i n -H A @H C P T 的颗粒性能T a b .3 P a r t i c l e p r o p e r t i e s o fZ e i n -H A @H C P Ta f t e r d i f f e r e n t s t o r a g e t i m e s i nP B Sb u f f e r (p H 7.4)存储时间平均粒径/n m 粒度分布指数Z e t a 电位/m V 新鲜制备383.5ʃ1.40.274-36.9ʃ1.91d 390.1ʃ2.60.226-42.5ʃ2.73d 396.8ʃ2.90.248-36.0ʃ0.87d 400.4ʃ2.50.232-31.9ʃ1.514d395.3ʃ3.20.333-30.4ʃ0.32.6 纳米颗粒的体外细胞毒性实验选用小鼠结肠癌细胞(C T 26细胞,C D 44高表达)探究Z e i n -H A@H C P T 对结肠癌细胞生长的影响.如图11所示,Z e i n -H A 空白载体对C T 26细胞几乎没有细胞毒性;随着载体浓度的增加,细胞活性呈现一定程度的增加,这可能是由于Z e i n -H A 的降解产物有助于C T 26的增殖.Z e i n -H A@H C P T 显示出比游离H C P T 更低的I C 50值,说明Z e i n -H A@H C P T 的细胞毒性更强,这可能是由于肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取能力高于游离药物,且包封在Z e i n -H A@H C P T 中的H C P T 呈无定形形态,溶解度相较于游离H C P T 有所提高,进而使H C P T 的生物利用度提高;同时Z e i n -H A@H C P T 优异的C D 44靶向能力使C D 44受体高表达的C T 26肿瘤细胞对Z e i n -H A@H C P T 的摄取增加,从而表现出更强的细胞毒性.图11 C T 26细胞毒性实验结果F i g .11 I nv i t r o c y t o t o x i c i t y ofH C P T ,Z e i n -H A @H C P Ta n dZ e i n -H At oC T 26c e l l s 2.7 纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向摄取能力为探究C T 26细胞对Z e i n -H A@H C P T 的摄取能力,本研究使用正置荧光显微镜观察Z e i n -H A@H C P T 的细胞摄取情况.如图12所示,随着H C P T 和Z e i n -H A@H C P T 与细胞的孵育时间从1h 延长至4h ,细胞内的荧光强度也逐渐增强,这表明H C P T 和Z e i n -H A@H C P T 被细胞内化的过程是时间依赖性的摄取过程.4h 时,H C P T 与Z e i n -H A@H C P T 的摄取能力差异与细胞毒性的结果吻合.为探究Z e i n -H A@H C P T 的C D 44靶向能力,通过设置H A 竞争实验,对贴壁生长24h 的C T 26细胞使用游离H A (0.5m g /m L )预处理1h 后,再给予不同的药物共同孵育4h ,观察肿瘤细胞对药物摄取能力的变化.如图12所示,C T 26细胞与Z e i n -H A@H C P T 共孵育的实验组中,细胞内几乎没有绿色荧121 第2期朱曙霞,等:基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究221杭州师范大学学报(自然科学版)2024年光;缺少C D44靶向配体的游离药物H C P T,即使在H A预处理后,细胞内仍显示出强烈的绿色荧光,具有较高的摄取能力.实验结果表明,Z e i n-H A@H C P T纳米颗粒是通过C D44受体介导的通路进行细胞摄取的.A:H C P T处理组;B:Z e i n-HA@H C P T处理组;标尺:40μm.图12C T26细胞中纳米颗粒的摄取能力F i g.12U p t a k e a b i l i t y o f n a n o p a r t i c l e s i nC T26c e l l s3结论抗结肠癌口服药物克服肠胃道p H㊁消化酶和黏膜等多重生理屏障,实现结肠病灶部位的靶向蓄积是当前面临的重要挑战.本研究使用超声透析法构建基于玉米醇溶蛋白-透明质酸的纳米复合载体,利用四因素四水平的正交实验优化实验参数,使用渴望函数法评价操作参数对多指标的影响.获取制备纳米颗粒的最优条件:Z e i n质量浓度为1.0m g/m L,HA分子质量为400k D a,反应温度为20ħ,超声功率为150W.使用一步法制备Z e i n-H A@H C P T纳米药物(包封率达95.85%),具备优异的抗胃酸分解特性,利用时间依赖性药物控制释放机制实现结肠靶向递送.通过考察Z e i n-H A@H C P T的生物稳定性㊁细胞毒性㊁细胞摄取等生物学性能,表明Z e i n-H A@H C P T纳米药物具有良好的生物稳定性㊁高效的细胞毒性和C D44受体靶向能力,可实现对结肠癌的靶向治疗.参考文献:[1]R E A C T TC O L L A B O R A T I V E ,Z A B O R OW S K IA M ,A B D I L EA ,e t a l .C h a r a c t e r i s t i c s o f e a r 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a c ht oa n t i c a n c e rd r u g c a r r i e r s [J ].A n g e w C h e mI n tE dE n gl ,2017,56(24):6712-6733.[10]G I T E R U S G ,A L I M A ,O E YI .R e c e n t p r o g r e s si nu n d e r s t a n d i n g f u n d a m e n t a l i n t e r a c t i o n sa n da p p l i c a t i o n so fz e i n [J ].F o o d H yd r o c o l l ,2021,120:106948.[11]L E IC ,L I U XR ,C H E N QB ,e t a l .H y a l u r o n i c a c i d a n da l b u m i nb a s e dn a n o p a r t i c l e sf o r d r ug d e l i v e r y [J ].JC o n t r o lR e l e a s e ,2021,331:416-433.[12]J I N X ,A S G H A RS ,Z HU X T ,e t a l .I nv i t r o a n d i nv i v o e v a l u a t i o no f 10-h y d r o x y c a m p t o t h e c i n -l o a d e d p o l y (n -b u t y l c y a n o a c r y l a t e )n a n o p a r t i c l e s p r e p a r e db y m i n i e m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o n [J ].C o l l o i d sS u r f BB i o i n t e r f a c e s ,2018,162:25-34.[13]C H E N S ,M C C L E M E N T S D J ,J I A N L ,e ta l .C o r e -s h e l lb i o p o l y m e rn a n o p a r t i c l e sf o rc o -d e l i v e r y o fc u r c u m i na n d p i pe r i n e :s e q u e n t i a l e l e c t r o s t a t i c d e p o s i t i o nof h y a l u r o n i c a c i d a n d c h i t o s a n s h e l l s o n t h e z e i n c o r e [J ].A C SA p p lM a t e r I n t e r f a c e s ,2019,11(41):38103-38115.[14]T OMA RD ,S I N G H PK ,H O Q U ES ,e t a l .A m o r p h o u s s y s t e m s f o r d e l i v e r y o f n u t r a c e u t i c a l s :c h a l l e n g e s o p p o r t u n i t i e s [J ].C r i tR e v F o o dS c iN u t r ,2022,62(5):1204-1221.[15]S I N HA V R ,K UM R I A R.M i c r o b i a l l y t r i g g e r e dd r u g d e l i v e r y to t h e c o l o n [J ].E u r JP h a r mS c i ,2003,18(1):3-18.[16]P A T E L M ,AM I N A.R e c e n t t r e n d s i nm i c r o b i a l l y a n d /o r e n z y m a t i c a l l y d r i v e n c o l o n -s p e c i f i c d r u g d e l i v e r y s ys t e m s [J ].C r i tR e vT h e r D r u g C a r r i e r S y s t ,2011,28(6):489-552.S t u d y o nC o l o n -t a r ge t e dO r a lN a n o m e d i c i n eB a s e do nZ e i n -H AC a r r i e r Z HUS h u x i a ,WA N G M e i l i n g ,X UZ i n i n g ,Y U Y u a n l o n g ,P A NJ i a n l i n ,WA N G H o n gd i (C o l le g e o fM a t e r i a l ,C h e m i s t r y a n dC h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,H a n g z h o uN o r m a lU n i v e r s i t y ,H a n gz h o u311121,C h i n a )A b s t r a c t :O r a l n a n o c a r r i e r s f o r c o l o n -t a r g e t e dm e d i c i n ed e l i v e r y b a s e do nZ e i n -h y a l u r o n i ca c i d (HA )w e r ed e s i gn e d i n t h i s s t u d y .T h e n a n o m e d i c i n e o f Z e i n -HA -h y d r o x y c a m p t o t h e c i n (Z e i n -HA@H C P T )w a s p r e p a r e db y t h e u l t r a s o u n d d i a l y s i s m e t h o d .T h e p r e p a r a t i o n c o n d i t i o n s o f t h en a n o m e d i c i n ew e r eo p t i m i z e db y d e s i r a b i l i t y f u n c t i o n .T h em i c r o s t r u c t u r e ,d r u gr e l e a s e b e h a v i o r ,c y t o t o x i c i t y a n d t a r g e t e d c e l l u l a r u p t a k e a b i l i t y o f t h e n a n o m e d i c i n ew e r e i n v e s t i g a t e d .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t Z e i n -HA@H C P T p o s s e s s e dah i g hd r u g e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y o v e r 95%.M e a n t i m e ,i t e x h i b i t e d e x c e l l e n t b i o l o g i c a l s t a b i l i t y ,b i o c o m p a t i b i l i t y ,a n du n i q u e g a s t r i ca c i dr e s i s t a n c e .T h ec u m u l a t i v er e l e a s eo fd r u g s i nt h ec o l o n i ce n v i r o n m e n t w a s s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d .F u r t h e r m o r e ,Z e i n -HA@H C P T w a s t a r g e t e da n d t a k e nu p b y c o l o nc a n c e r c e l l s t h r o u ghC D 44r e c e p t o rm e d i a t e de n d o c y t o s i s ,w h i c hc a n i m p r o v e t h e a n t i -t u m o r e f f i c a c y o f d r u gs .K e y wo r d s :Z e i n ;h y a l u r o n i c a c i d ;h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ;c o l o n -t a r g e t e d 321 第2期朱曙霞,等:基于玉米醇溶蛋白-透明质酸载体的结肠靶向口服纳米药物研究。
