荧光实时定量PCR检测线粒体DNA氧化损伤方法初探

荧光定量PCR实验报告摘要：荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种通过扩增和定量DNA的方法。

本实验的目的是利用荧光定量PCR技术，对给定的DNA样品进行定量检测，并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。

实验结果表明，荧光定量PCR是一种快速、准确、高灵敏度的定量PCR方法。

引言：荧光定量PCR技术是PCR技术的一种发展，并且在分子生物学中得到广泛应用。

它可以实时监测PCR扩增反应中DNA的扩增情况，因此被广泛用于基因表达检测、基因拷贝数检测、病原体检测等领域。

在这个实验中，我们将利用荧光定量PCR技术检测给定DNA样品的浓度并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。

材料与方法：1.实验材料：（1）实验电脑：配备实时荧光定量PCR软件的计算机。

（2）实验试剂：-PCR反应混合液：包含DNA模板、引物、荧光染料、酶等。

- 模板DNA：浓度为10 ng/μL的DNA样品。

-引物：用于扩增目标DNA的引物。

-荧光染料：用于实时检测PCR扩增过程中的DNA量。

（3）实验仪器：实时荧光定量PCR仪。

2.实验步骤：（1）制备PCR反应混合液，包括DNA模板、引物、荧光染料和酶。

（2）将PCR反应混合液分装到PCR试管中。

（3）将不同浓度的模板DNA分别加入PCR试管中。

（4）使用实时荧光定量PCR仪将PCR试管放入仪器中，进行PCR扩增反应。

（5）实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，并记录荧光信号的变化。

结果与讨论：本实验中，我们选取了不同浓度的模板DNA样品并进行PCR扩增反应。

实时荧光定量PCR仪可以实时监测PCR反应中的荧光信号，并根据荧光信号的强度来定量PCR扩增产物的量。

实验结果显示，荧光信号随着PCR反应的进行逐渐增强，并且荧光信号的强度与模板DNA的浓度呈正相关关系。

通过测量荧光信号的强度，我们可以计算出不同浓度的模板DNA的扩增产物的量，进一步定量DNA样本的浓度。

荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。

荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。

本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。

第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。

2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。

应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。

3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。

4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。

6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。

7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。

8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。

第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。

2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。

第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。

2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。

- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。

线粒体损伤机制及测定方法线粒体是细胞内的重要细胞器，主要负责细胞内能量代谢和细胞呼吸过程。

然而，由于环境因素、遗传变异或疾病等原因，线粒体损伤可能会发生，导致细胞功能异常甚至细胞死亡。

线粒体损伤的机制主要包括氧化应激、电子传递链障碍、钙离子稳态紊乱、线粒体外膜通透性转变等。

在氧化应激过程中，细胞内产生过多的活性氧化物，超过线粒体抗氧化能力的清除能力，使线粒体的膜结构、蛋白质和DNA受到损伤。

电子传递链障碍则会导致线粒体内的能量产生减少，使细胞缺乏能量供应。

钙离子稳态紊乱时，线粒体内外的钙离子浓度失衡，导致线粒体功能异常。

线粒体外膜通透性转变是指线粒体外膜通透性增加，引发细胞内细胞色素C的释放和细胞凋亡。

为了准确测定线粒体损伤，科学家提出了多种方法。

一种常用的方法是通过检测线粒体膜电位的变化来评估线粒体损伤程度。

线粒体膜电位的降低往往与线粒体损伤相关，可以通过使用荧光探针，如JC-1染料来测定。

JC-1染料在高内膜电位时形成聚集态的红色荧光，而在低内膜电位时形成分散态的绿色荧光，从而可间接测定线粒体膜电位的变化。

另一种常用的方法是通过检测线粒体氧化还原状态来评估线粒体损伤程度。

可以使用氧化还原敏感的荧光探针，如MitoSOX Red和DCFDA来测定线粒体内活性氧化物的产生。

这些探针能够进入线粒体，被活性氧化物氧化后产生荧光信号，从而可以推断线粒体内氧化还原状态的变化。

此外，还可以通过检测线粒体蛋白质的释放来评估线粒体损伤程度。

细胞内线粒体损伤后，线粒体外膜通透性转变会导致线粒体蛋白质如细胞色素C从线粒体内释放到细胞质中。

可以使用免疫印迹或免疫荧光等方法来检测这些线粒体蛋白质的释放情况。

综上所述，线粒体损伤的机制涉及多个方面，包括氧化应激、电子传递链障碍、钙离子稳态紊乱和线粒体外膜通透性转变。

为了准确测定线粒体损伤程度，可以使用线粒体膜电位的变化、线粒体氧化还原状态以及线粒体蛋白质的释放来评估。

这些测定方法将有助于深入理解线粒体损伤的机制，并为相关疾病的预防和治疗提供理论依据。

实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。

收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法。

目前，实时荧光定量PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。

在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。

实时荧光定量PCR的应用目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：● 基因扩增● 扩增特异性分析● 基因定量分析● 基因检测● 基因分型● SNP分析● RFLP多态性分析● 单/多基因表达研究● 高通量基因表达谱研究……实时荧光定量PCR的常用方法染料法荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA 中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。

同时，其缺点也在于其非特异性。

当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。

常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。

Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.探针法在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

荧光定量PCR结果分析一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。

⼀⽂看懂：荧光定量PCR的原理、⽅法及结果分析⾃从1983年K. Mullis发明聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。

⽽实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加⼊荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进⾏定量分析的⽅法。

⽬前，实时荧光定量 PCR 已成为不同样品间进⾏基因表达⽔平定量差异⽐较的权威性⽅法。

在过去⼗⼏年中，该⽅法迅速流⾏，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、⼯业和医学研究。

实时荧光定量PCR的应⽤⽬前，qPCR技术已经⼴泛应⽤于⽣物医药⾷品等⾏业，应⽤于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、⾷品病原微⽣物的检测、转基因⾷品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：●基因扩增●扩增特异性分析●基因定量分析●基因检测●基因分型● SNP分析● RFLP多态性分析●单/多基因表达研究●⾼通量基因表达谱研究……实时荧光定量PCR的常⽤⽅法　染料法荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺⼊双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。

同时，其缺点也在于其⾮特异性。

当PCR反应中有引物⼆聚体或者⾮特异性扩增时，该染料也可以和这些⾮特异性扩增产物结合，发出荧光，从⽽⼲扰对特异性产物的准确定量。

常⽤的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作⽤等进⾏改进，也推出了很多新的染料供⼤家选择。

Promega采⽤新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作⽤，与双链DNA结合后荧光信号更强.探针法在PCR扩增时加⼊⼀对引物的同时加⼊⼀个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸：5’端标记⼀个报告荧光基团，3’端标记⼀个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号。

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中添加一种或多种荧光标记的探针，它与目标序列的特定区域互补，当探针与目标序列结合时，荧光信号被激发，产生荧光发射。

随着PCR反应的进行，目标序列的数量增加，荧光信号也随之增强。

通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号强度的变化，可以推断出起始模板的数量。

操作上，实时荧光定量PCR主要分为两个步骤：反转录和PCR。

首先，反转录将RNA逆转录合成cDNA，得到DNA模板。

然后，在PCR反应中，将DNA模板与荧光标记的探针、引物和核酸酶混合，开始PCR扩增。

PCR反应体系中的荧光探针在PCR扩增过程中的特定温度下与目标序列结合，产生荧光信号。

荧光信号被特定的光学设备检测和记录，得出PCR产物的数量。

实时荧光定量PCR具有广泛的应用领域。

在基因表达分析方面，qPCR可以用来定量测量特定基因的转录水平，研究基因的表达模式和差异。

在病原微生物检测方面，qPCR可以快速、准确地检测和鉴定细菌、病毒和寄生虫等病原体。

在遗传疾病诊断和监测方面，qPCR可以检测一些突变、插入或缺失等遗传变异，并进行遗传病的筛查与诊断。

此外，qPCR还可以用于检测和定量分析环境样品中的微生物、植物和动物等生物种群，了解物种多样性、群落结构和生态系统功能。

实时荧光定量PCR的优点包括高灵敏度、高特异性、高准确性和高重复性。

与传统PCR方法相比，qPCR不需要进行凝胶电泳分析，减少了实验操作的时间和手动操作的误差。

另外，荧光定量PCR还可以采用多通道检测不同靶标，提高实验的高通量性。

然而，实时荧光定量PCR也有一些局限性。

首先，荧光标记的探针需要根据目标序列的特点设计，设计不当可能会导致假阳性或假阴性结果。

其次，荧光信号的准确性受到反应物质的浓度和质量的影响，需要进行严格的实验操作和数据分析。

此外，实时荧光定量PCR的设备和试剂比传统PCR更昂贵，需要专业的实验室设施和经验。

T logy科技食品科技肉类是人类获取蛋白质的主要来源之一，其中的营养物质是维持人类生命活动所必需的。

从蛋白质水平和核酸水平上对肉类成分进行分析已经成为解决肉类掺假问题的主要手段。

在蛋白水平上，常常通过液相色谱、ELISA（酶联免疫吸附反应）以及高效液相色谱等对样品的成分进行分析。

但这类方法在检测加工样品时的特异性、准确性较差，且对检测样品的处理和仪器的要求较高。

在核酸水平上进行检测时，由于DNA的稳定性和特异性可以较为准确的对待测样品的成分进行分析。

目前这类检测方法中的DNA 探针杂交、普通PCR、限制性片段长度多态性扩增以及荧光定量PCR在肉类来源的检测中应用的较多[1-4]。

1　荧光定量PCR技术的检测 原理聚合酶链式反应（PCR）最早是KaryMullis在分析疾病基因时发明的[5]。

而荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上，将能够发出荧光信号的探针或染料与引物一起加入到反应体系中，根据碱基互补配对原则进行半保留复制，通过对荧光信号的收集达到实时监控PCR过程的目的[6]。

该方法在封闭的体系中进行扩增和实时监测，无需电泳就能得出结果，且在一定程度上避免了检测样品之间的交叉污染。

同时，荧光定量PCR的模板序列较短，可以缩短检测时间，快速得到检测结果。

而根据产生荧光信号方式的不同，荧光定量PCR技术可分为Taq Man 探针法和SYBR Green I荧光染 料法。

2　荧光定量PCR技术在肉制品检测过程中的应用使用实时荧光定量PCR技术对肉制品肉源的检测主要是检测动物细胞中线粒体相关基因。

众所周知，线粒体DNA是细胞质遗传的，具有含量多、分裂快等优点，同时不同组织部位中线粒体DNA的含量具有很大的差异。

因此对肉制品中肉种类以及数量的检测通常选用线粒体基因。

此外，相比较核基因，线粒体基因的检测具有较高的灵敏度和稳定性。

常用作检测肉类来源的线粒体基因主要是细胞色素b基因、细胞色素c氧化酶亚基基因和线粒体D-loop区域的基因[4，7]。