免疫组化IHC抗体常见染色问题

免疫组化（Immunohistochemistry）技术常见问题及其解答集锦-2 10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0。

3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。

（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

（3）现用现配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脱蜡？（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。

为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。

如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。

如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。

（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。

总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条。

（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。

全套鼠类器官组织切片； 全套猴类器官组织切片； 人类常见癌症组织切片； 组织芯片客户定制服务。
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。

1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。

经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。

该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。

随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。

但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。

本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。

1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。

排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。

可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。

解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。

如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。

如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。

1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。

解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。

免疫组化（IHC）常见问题解析2162 人阅读发布时间：2020-10-22 15:54免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。

然而理想是丰满的，实际操作起来却是骨感的，作为一种分析方法，常常会存在非特异着色的背景问题。

下图中靶点均为胞膜定位，左边背景着色严重，右边染色效果优良。

01 抗体质量问题抗体本身在靶点设计上如果特异性不够，会导致非特异着色。

一般来说，单抗在特异性上相比多抗是具有优势的，但多抗由于识别任一抗原上的多个表位，多抗可放大低表达水平靶蛋白的信号，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强，可用于非免疫原物种的靶蛋白的检测实验。

具体实验时，还应根据实际需要选择合适的抗体。

另外，抗体保存也应注意防腐及防止反复冻融。

02 内源性酶和生物素当选用肝、肾，脾组织作为样本时，由于这些组织本身含有较高含量的过氧化酶和生物素，对于使用Hrp或生物素-亲和素显色系统的实验都会造成非特异性染色。

对于内源性过氧化物酶，可以用0.9% 的双yang水来灭活。

对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL 亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即可染色。

也可以24 mg/mL 的卵白素封片15 分钟。

03 抗体浓度过高获得良好的染色结果，一般应优化一抗的使用浓度，可参考供应商提供的说明书，但预实验也是必不可少的，摸索出最理想的工作浓度。

04 DAB 染色时间太长/变质DAB 的作用时间过长，同样会造成背景。

DAB 的显色时间不是一成不变的，实验时应及时镜检，出现浅棕色时，马上冲洗。

出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体有效浓度过低。

DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。