BSA—PLGA缓释微球制备工艺的优化

２５６２　实用医学杂志２００９年第２５卷第ｌ５期　

・检验与临床・　

ＢＳＡ—ＰＬＧＡ缓释微球制备工艺的优化　

曾晗冰李万里徐华梓　李士　

摘　要　目的：以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）为模型蛋白，乳酸／羟乙酸共聚物（ＰＬＧＡ）为载体，优化微球的制备工　艺。方法：采用复乳溶剂挥发法制备ＢＳＡ—ＰＬＧＡ微球，以包封率、载药量、粒径及２４　ｈ释放率等为观察指标，通过　正交设计法优化显著影响微球制备工艺条件的７种因素：结果：优化后的工艺条件是ＢＳＡ用量为５　ｍｇ、ＰＥＧ用量为　０．２ｍＬ、ＰＬＧＡ用量为２００ｍｇ、ＰＶＡ浓度为ｌ％、ＮａＣ１浓度为１０％、超声功率为４０ｗ、复乳搅拌速度为１　０００　ｒ／ｍｉｎ。结　论：该制备工艺简单、稳定，可以得到包封率高、粒径适宜、突释较少的ＢＳＡ—ＰＬＧＡ微球。　关键词微球体；　血清白蛋白，牛；　乳酸盐类：　聚合物；　药物载体　

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＳＡ－ＰＬＧＡ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ・ｒｅｌｅａｓｅ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ＺＥＮＧ　Ｈａｎ—ｂｉｎｇ　，ＬＩ　Ｗａｎ－ｌｉ，ＸＵ　Ｈｕａ－　ｚｉ，ＬＩＳｈｉ　ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｐｉｎｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＷｅｍｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｋｇｅ．Ｗｅｎｚｈｏｕ　３２５０２７，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＸＵ　Ｈｕａ—ｚｉ　Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｐｉｎｅｘｕ＠１６３．ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＢＳＡ　ａｓ　ｍｏｄｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ＰＬＧＡ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ—ｒｅｌｅａｓｅ　ｃａｒｒｉｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＢＳＡ—ＰＬＧＡ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ（ｗａｔｅｒ．ｉｎ．ｏｉｌ）ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｕｓｉｎｇ　ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ　ｅｆｆｃｉｅｎｃｙ，ｌｏａｄｉｎｇ　ｅｆｆｃ￣ｅｎｅｙ，ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ，ａｎｄ　２４　ｈ－ｒｅｌｅａｓｅ　ａｍｏｕｎｔ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ，ｗｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｔｈｅ　７　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｍａｒｋｅｄｌｙ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ＢＳＡ　ｏｆ　５　ｍｇ，ＰＥＧ　ｏｆ　０．２　ｍＬ，ＰＬＧＡ　ｏｆ　２００　ｍｇ，ｌ％ＰＶＡ，１０％ＮａＣ１，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ　ｏｆ　４０　Ｗ，ａｎｄ　ｓｔｉｒｒｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｏｆ　１　０００　ｒ－ｍｉｎ一１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ＢＳＡ—ＰＬＧＡ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ．ｂｙ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅ　ｃａｎ　ａｃｑｕｉｒｅ　ｔｈｅ　ｍｉｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｌｏｗ　ｂｕｒｓｔ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｍｏｕｎｔ，ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；　ＢＳＡ；ＰＬＧＡ；Ｐｏｌｙｍｅｒ；Ｄｒｕｇ　ｃａｒｒｉｅｒ　

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）是一种　

具有促进和维持神经细胞生长、存活和分化作用的特　

异性蛋白质。它不仅对正常的神经系统有营养作用，　

而且还在中枢神经系统损伤的修复中起重要作用，单　

纯应用ＮＧＦ能够诱导轴突再生…。但是由于ＮＧＦ属　

于多肽蛋白质，难以通过血脑屏障，且其生物半衰期　

短，需反复给药才能维持有效浓度。使得神经生长因　

子的临床应用受到了很大的限制　

因此，建立可长期在局部持续释放ＮＧＦ的新型　

给药系统，将有助于更有效地促进受损神经功能的恢　

复。近年来，以人工合成的生物可降解高分子材料为　

控释载体来制备微球，已经越来越多地引起了人们的　

兴趣。其中乳酸／羟乙酸共聚物（ＰＬＧＡ）为应用最广　

泛的一种聚合物材料，它具有良好的生物降解性及　

组织相容性，无毒性等优点，已被美国ＦＤＡ批准用　

于临床［　。以往的研究多集中于单一制备工艺对　

ＢＳＡ．ＰＬＧＡ微球性状的影响，而对于微球制备工艺的　

基金项目：浙江省自然科学基金项目（编号：Ｙ２０８０５０７）：温州市科　技局资助项目（编号：Ｈ２００８００３１）　作者单位：３２５０２７温州医学院附属第二医院脊柱外科（曾晗冰，　徐华梓，李士）；３１０００９杭州市，浙江大学医学院附属第二医院骨科　（李万里）　通信作者：徐华梓Ｅ．ｍａｉｌ：ｓｐｉｎｅｘｕ＠１６３．ＣＯＩＩＩ　综合考察则较少有文献报道。本实验以牛血清白蛋白　

（ＢＳＡ）为模型蛋白，ＰＬＧＡ为载体材料，采用复乳溶剂　

挥发法制备ＢＳＡ．ＰＬＧＡ缓释微球，同时综合考察各工　

艺因素对微球粒径、包封率、释放率等的影响，从而达　

到制备工艺优化的目的，为ＮＧＦ—ＰＬＧＡ缓释微球的制　

备打下前期基础　

１材料与方法　

１．１　主要试剂　牛血清白蛋白（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ公司）；　

ＰＬＧＡ（ＰＬＡ／ＰＧＡ　７５／２５，Ｍｗ＝２０　０００，黏度＝０．２５．山　东省医疗器械研究所）；聚乙烯醇（日本可乐丽公司，　

ＰＶＡ．１２４）；聚乙二醇４００（ＰＥＧ４００，德国ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ公　

司）；Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｋｉｔ（美国Ｐｉｅｒｃｅ公司）：十二烷基硫酸　

钠（ＳＤＳ）、二氯甲烷、氯化钠、氢氧化钠、丙酮和磷酸　

盐缓冲溶液（ＰＢＳ）等均为分析纯。　

１．２仪器设备超声波细胞粉碎机（美国Ｂｒａｎｓｏｎ．Ｓ一　

２５０Ｄ）；悬臂式搅拌机（德国ＩＫＡ，ＲＷ２０）；磁力搅拌机　

（上海雷磁，ＪＢ．３）；真空冷冻干燥机（北京德天佑，ＦＤ一　

１）；恒温振荡水浴摇床（上海跃进，ＳＨＺ．Ａ）；倒置显微　

镜（１３本ＯＬＹＭＰＵＳ，ＣＫＸ４１）；激光粒度仪（美国　

Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，９０Ｐｌｕｓ）；恒速搅拌器（上海申生，￥３１２）：　

紫外分光光度仪（英国Ｊｅｎｗａｙ，６４０５）；高速低温离心　

机（上海天美，ＣＴＩ５ＲＴ）；扫描电子显微镜（日本日　

立，Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓ－３０００Ｎ）。　１．３　ＢＳＡ．ＰＬＧＡ缓释微球的制备

采用Ｗ／Ｏ／Ｗ复　实　堂鍪查　旦　星鹱２５鲞笙　

乳溶剂挥发法制备缓释微球［３］。将一定量的ＢＳＡ干　

粉和表面活性剂ＰＥＧ用１００　Ｌ双蒸水溶解后得内　

水相（Ｗ１），适量ＰＬＧＡ溶于４　ｍＬ二氯甲烷／丙酮　

（体积比３：１）混合物中得油相（０），将Ｗ１倒人０　

中，冰浴下超声处理３０　Ｓ得到初乳：将适量ＰＶＡ溶　

于３０　ｍＥ一定浓度的氯化钠双蒸水溶液中得外水相　

（Ｗ２）；将初乳缓慢倒入Ｗ２中，冰浴下以恒定速率搅　

拌５　ｒａｉｎ．得Ｗ１／Ｏ／Ｗ２复乳，将复乳倒人４００　ｍＬ相　

同浓度的氯化钠双蒸水溶液中，冰浴下磁力搅拌４　ｈ　

挥发残余有机溶剂，通过０．４５　ｍ微孑Ｌ滤膜过滤收　

集微球，并用１００　ｍＬ去离子水洗涤５次，真空冷冻　

干燥机上冷冻干燥４８　ｈ，得ＢＳＡ．ＰＬＧＡ微球，置于　

４ｃＣ保存。　

１．４微球包封率的测定　精密称取干燥ＢＳＡ微球　

１０　ｍｇ，加入４　ｍＬ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＤＨ（含０．５％ＳＤＳ）溶　

液，３７ｃｃ恒温水浴振荡２４　ｈ，使微球完全溶解。加入　０．２　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣＩ溶液调节ｐＨ至７．０．用ＢＣＡ微量蛋白　

测定法测得吸光度，以空白微球降解液作为空白对　

照，代入标准曲线，计算ＢＳＡ的含量　。　

微球包封率（％）＝（微球中测定得的ＢＳＡ量／　

微球中理论的ＢＳＡ量）×１００％　

微球载药量（％）＝（微球中测定的ＢＳＡ量／微球的　

重量）ｘｌＯ０％　１．５　ＢＳＡ微球的体外释放实验　准确称取２０　ｍｇ　

ＢＳＡ微球置于ＥＰ管中，加入１　ｍＬ　ＰＢＳ液（ｐＨ　７．４），　

振荡混匀后放置于３７℃恒温摇床中．以１５０　ｒ／ｒａｉｎ　

的速度进行释放试验。在预先设定的时间内离心　

（１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ，５　ｒａｉｎ）取上清液，并补充等量同温新　

鲜ＰＢＳ，继续振荡。所取上清液用１．４中ＢＣＡ微量蛋　

白法测定ＢＳＡ浓度，重复３次，计算ＢＳＡ的释放量　

微球在释放初期会大量释放出所载药物，这种现象称　

为“突释”，一般用２４　ｈ累积释放率（％）来衡量其程　

度　引。　

ＢＳＡ微球２４　ｈ释放率（％）＝（微球中ＢＳＡ　２４　ｈ　

累积释放量／微球中实际ＢＳＡ含量）×１００％　

１．６考察制备工艺条件对ＢＳＡ微球性质的影响在　

单因素考察法的基础上，固定内水相水体积为１Ｏ０　

Ｌ，油相体积为４　ｍＬ，外水相体积为３０　ｍＬ，超声时　

间为３０ｓ，初乳搅拌时问为５　ｒａｉｎ．选定内水相ＢＳＡ用　

量（Ａ）、内水相ＰＥＧ用量（Ｂ）、油相ＰＬＧＡ用量（Ｃ）、外　

水相ＰＶＡ浓度（Ｄ）、外水相中ＮａＣ１浓度（Ｅ）、超声功　

率（Ｆ）、复乳搅拌速度（Ｇ）等７个对微球性质影响较　

显著的参数作为实验因素，每个因素选择２个水平，　

每组实验重复３次，以微球包封率及２４　ｈ释放率为　

考察指标，兼顾微球粒径，采用Ｌ８（２，）正交试验设计　

表进行正交试验筛选优化制备工艺，见表１。　

表１正交试验因素和水平表　

１．７微球表观形态学的考察　

１．７．１　微球粒径及分布图的测定取少量载药微球　

溶解于去离子水，混匀后．放人激光粒度分析仪中测　

定微球的直径及粒径分布。　

１．７．２微球外形的观察取少量ＢＳＡ—ＰＬＧＡ缓释微　

球放置于贴有双面胶的金属板上。喷金制成扫描电镜　

标本，观察其外形。　

１．８验证实验按优化条件制备３批ＢＳＡ．ＰＬＧＡ微　

球干粉，考察其形态、粒径、包封率、载药量及突释情　

况，以验证微球制备工艺的可重复性。　

２结果　

２．１　ＢＳＡ缓释微球制备工艺的筛选优化按Ｌ８（２　）　正交试验设计表设计７个处方，以包封率、２４　ｈ释放　

率及粒径为评价指标，筛选制备工艺，正交试验结果　

见表２。　

２．１．１　ＢＳＡ缓释微球制备工艺对微球包封率的影响　

极差Ｒ反映各因素对指标影响的程度，极差越大，　

影响程度越大。由表２可见制备工艺对微球包封率的　

影响大小顺序为：Ｃ＞Ｆ＞Ａ＞Ｄ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｅ。油相中　ＰＬＧＡ和超声功率对微球包封率影响最明显，当两种　

参数增加时，微球的包封率显著增加：内水相ＢＳＡ含　

量增加时，微球的包封率反而减少：而外水相ＰＶＡ浓　

度增大，微球的包封率也增加：当复乳搅拌速度增大　

时，微球的包封率反而减少；内水相ＰＥＧ用量和外水　

相ＮａＣ１浓度对微球包封率影响则不明显。故正交设　

计所得最佳实验方案为Ａ　Ｂ。Ｃ：Ｄ：Ｅ。Ｆ：Ｇ　，即内水相　

ＢＳＡ用量为５　ｍｇ、ＰＥＧ用量为０．１　ｍＬ、油相ＰＬＧＡ用　

量为２００　ｍｇ、外水相ＰＶＡ浓度为２％、ＮａＣ１浓度为