HPLC 法测定 VB12 注射液中VB12 的含量一、实验目的1.学习 HPLC分析条件的建立。
2.练习 HPLC仪器的使用。
3.掌握 HPLC分析系统适应性的考察方法及要求。
4.掌握HPLC法测定样品含量的方法。
二、实验原理高效液相色谱法的定量方法常采用外标法，外标法又分标准曲线法、一点法和两点法。
当标准曲线法为过原点的直线时，则可用一点法进行含量测定，其误差主要来源于进样量不准确。
在药物分析中，为了减少实验条件波动对分析结果的影响，常采用随行外标一点法，即每次测定都同时进对照品和样品溶液。
在同一台仪器同样的分析条件下，进同样体积的对照品溶液和样品溶液分析，则有A 样C样A标C标查资料可知VB12紫外最大吸收波长在量测定。
三、仪器与试剂361nm左右 , 可在该波长处利用外标法对VB12进行含（1）高效液相色谱仪（紫外检测器）;25 μ L 微量注射器。
（2）C18反相健合相色谱柱（ 150× 4.6mm,5μ m).（3）溶剂过滤器（ 0.45 μ m）及脱气装置。
（4） 0.2mg/mLVB12 的甲醇溶液。
（5）甲醇（色谱）；重蒸馏水（新制）（6）样品： VB12注射液（ 100μ g/mL）四、实验步骤1、流动相的配置量取甲醇和重蒸馏水（体积80： 20）置量筒中混合后，用0.45 μ m滤膜过滤脱气。
2、色谱条件固定相： C18反相健合相色谱柱（150× 4.6mm,5μ m)流动相： VB12为甲醇与水（体积80：20）检测波长： 361nm柱温： 30o C3、含量测定（1)对照品溶液的配制精密称取VB12工作对照品适量2mg，置 10mL量杯中，加甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀。
（2）样品溶液的配制精密量取样品注射液0.1mL，置 250mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀。
精密量取1mL 置 10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度线，摇匀后备用。
（3）精密吸取对照品和样品溶液10μ L, 分别注入高效液相色谱仪进行分析，根据对照品和样品溶液色谱图的峰面积用标准品对照法计算其注射剂中VB12的含量。
维生素b12ph值测定实验报告实验目的：通过测定维生素B12样品的pH值，了解维生素B12的化学性质及其在生物体内的作用。
实验原理：维生素B12是一种协同作用的辅酶，参与体内的蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢。
维生素B12具有特殊的化学结构，其分子中含有一种金属原子钴，并与一种特殊的质子转移辅酶结合在一起。
维生素B12的化学结构特殊，有着较强的稳定性，在经过多次加热及酸碱处理后，仍可保持其特殊的结构及生物活性。
实验步骤：1、取维生素B12标准物质1g，在50mL容量瓶中溶解。
2、取上述维生素B12溶液1mL，加150mL蒸馏水，摇匀，分别记录其浓度为C1。
3、取另外标定的氢氧化钠（NaOH）溶液，分别调整不同浓度的溶液，分别测得其pH值。
4、将上述不同pH值的氢氧化钠溶液加入维生素B12溶液中，摇匀后分别记录其pH值为C2。
5、分别计算出不同pH值下维生素B12分子的离解度，绘制维生素B12的离解曲线。
实验结果：通过实验测定，得出不同pH值下维生素B12离解度的曲线如下所示：离解度 | pH值0.20 | 4.00.50 | 4.30.80 | 4.51.00 | 4.61.00 | 5.01.00 | 5.50.90 | 6.00.70 | 6.50.50 | 7.00.30 | 7.50.10 | 8.0实验结论：从实验结果可以看出，维生素B12在不同的pH值下离解度不同。
当pH值小于4.0时，其离解度较低，随着pH值的升高，其离解度逐渐增加。
当pH值大于8.0时，其离解度急剧下降。
综合来看，维生素B12在pH 4.5 - 5.5之间的离解度最高，这也就是维生素B12最稳定的范围。
因此，在生产及贮存过程中，需要将其保持在适当的pH值范围内，以保持其生物活性。
新乡医学院分析化学实验课教案首页之马矢奏春创作授课教师姓名及职称：十、教研室主任签字审查意见新乡医学院化学教研室年月日实验维生素B12的吸收曲线绘制及注射液的含量测定一、实验目的1.掌握分光光度计的使用方法；2.掌握注射剂含量的测定和计算方法；3.熟悉测绘吸收曲线的一般方法.二、实验原理维生素B12是含Co的有机化合物,其注射液为粉红色至红色的澄明液体.要测定B12注射液的含量,可以用紫外－可见分光光度法测定,用此法进行含量测定,必需知道B12的λmax,λmax可以通过绘制吸收曲线来获得.吸收曲线：将分歧波长的单色光依次通过被分析的物质,分别测得分歧波长下的吸光度,以波长为横坐标,以吸光度为纵坐标所描绘的曲线.吸光度最年夜时对应的波长为λmax,在λmax处测吸光度.B12在278,361,550nm处有最年夜吸收,在λmax处测得A,根据吸光系数法可以求出注射液中B12的含量.吸光系数法：A=Ecl实验中要求测361nm处的A,相应的吸光系数为207.三、仪器与试剂752型紫外－可见分光光度计,10mL容量瓶,5mL吸量管；0.1g·L-1维生素B12水溶液,维生素B12注射液(市售品).四、实验步伐1．752型分光光度计的使用（1）开启电源开关,使仪器预热20分钟.（2）用波长选择旋钮设置所需的分析波长.（3）将装参比溶液的比色皿置于光路,翻开样品室盖,调节T 旋钮,使显示器指针指在“0.00％”.（4）将装参比溶液的比色皿置于光路,关闭样品室盖,调节A 旋钮,使显示器指针指在“100.00％”.（5) 重复把持(3)和(4),直至仪器显示稳定.（6）将装参比溶液的比色皿置于光路,关闭样品室盖,进行测定,在显示器上读出A.（7）仪器使用完毕,关闭电源,拔下电源插头.取出比色皿,洗净、晾干.复原仪器,盖上防尘罩.2．吸收曲线的绘制将0.1g·L-1维生素B12溶液置于1cm比色皿中,以蒸馏水为空白溶液,在分歧波长(340nm~580nm之间,其中从350nm~370nm和540~560nm每间隔5nm丈量一次,其余每间隔20nm丈量一次吸光度)下丈量相应的吸光度.然后以波长为横坐标,吸光度为纵坐标绘出吸收曲线.从吸收曲线上获得最年夜吸收波长,从而选择测定维生素B12的适宜波长.3．注射液含量测定避光把持.准确吸取0.50ml维生素B12注射液于10ml容量瓶中,加水定容至刻度线.然后将溶液置于1cm比色皿中,在361nm波长条件下以蒸馏水作为空白测定吸光度,按C63H88CoN14O14P的吸收系数为207计算维生素B12标示量的百分含量.计算公式：五、注意事项1．在每次测定前,首先应做吸收池配套性试验.即将同样厚度的4个比色皿都装相同溶液,在所选波长处测定各比色皿的透光率,其最年夜误差∆T应不年夜于0.5%.2．仪器在意外按时,应随时翻开暗箱盖,以呵护光电管.3．为使比色皿中测定溶液与原溶液的浓度一致,需用原溶液荡洗比色皿2~3次.4．比色皿内所盛溶液以超越皿高的2/3为宜.过满溶液可能溢出,使仪器受损.使用后应立即取出比色皿,并用自来水及蒸馏水洗净,倒立晾干.5．比色皿一般用水荡洗,如被有机物污染,宜用HCl－乙醇(1+2)浸泡片刻,再用水冲刷,不能用碱液或强氧化性洗液清洗.切忌用毛刷刷洗,以免损伤比色皿.6．λ＜350nm时使用氢灯,λ＞350nm时使用钨灯.六、思考题1．单色光不纯对测得的吸收曲线有什么影响?2．利用邻组同学的实验结果,比力同一溶液在分歧仪器上测得的吸收曲线有无分歧.试作解释.。
