溶菌酶结构特点及分离纯化的研究
摘要：本文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍，并对近年来溶菌酶分离纯化的方法,如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃取法等进行了综述。
关键词：溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化
1 前言
溶菌酶(1ysozyme;EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。在自然界中,溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷心菜等植物中以及微生物中也含此酶[1],其中以蛋清含量最为丰富，约0.3%[2]。
2 溶菌酶的结构特点和作用机制
2.1 溶菌酶的类型
溶菌酶按其所作用的微生物不同分为两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1.4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[3]。
2.2 溶菌酶的结构
鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。Phillips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂,α螺旋仅占25％,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。
2.3 溶菌酶的性质
溶菌酶是一种碱性球蛋白,等电点高达10.7～11.0,分子内有4个二硫键交联,化学性质非常稳定,对热也极为稳定,作用的最适温度为45～50℃。当pH值在1.2 ～11.3 范围内剧烈变化时,其结构几乎不变；在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强,pH4～7,100℃处理1min仍能保持原酶活性；pH3 时能耐100℃加热处理45min。目前了解最清楚并投入商业化生产的是鸡蛋蛋清溶菌酶,其分子量为14000,等电点为11.1,最适溶菌温度为50℃,最适pH 为7,鸡蛋蛋清溶菌酶化学性质非常稳定,在pH4～7的范围内, 100℃处理1min仍保持原酶活性,但在碱性环境中该酶对热稳定性较差[4] 。在干燥条件下溶菌酶可以长期在室温下存放, 其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定形粉末、无臭、味甜,易溶于水,遇碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚等[5]。
2.3 作用机制
溶菌酶具有分解细菌细胞壁中肽聚糖的特殊作用。细菌的细胞壁由胞壁质组成,胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylalucosamine)N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid) 交替组成的多聚物,胞壁酸残基上可以连接多肽,称为肽聚糖(Pep tidoglycan)。多糖以直链形式存在,彼此邻近的多糖链之间可以通过肽链部分相互连接,从而形成三维结构。酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸, 溶菌酶通过其肽键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成微生物细胞壁肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸(NAM)N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β-1,4糖苷键,使细胞因渗透压不平衡引起破裂,从而导致菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的[6]。
3 溶菌酶的分离纯化方法
随着各种新的生物分离技术的出现,用于溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多,从最初的直接结晶法,沉淀法到亲和色谱法、离子交换法,特别是现在采用的新技术如亲和膜色谱、反胶团萃取、双水相萃取[7] 、亲和沉淀等。
3.1 结晶法
1946 年Alderton 报道生长出四方晶系的溶菌酶晶体。后来,Pusey[8]用接种法测量了溶菌酶溶解度随温度的变化,Rosenberger[9]用配液法测量了溶菌酶溶解度和pH 值的关系。在此基础上,Howard[10]测定了不同NaCl 浓度下溶菌酶的溶解度。20世纪80年代初,人们已经得到溶菌酶溶解度随温度、pH 值变化的三维曲面图。
结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法,其提取的原理是利用溶菌酶耐温、耐酸及在盐溶液中稳定性好、溶解性强的特点,向蛋清中加入一定量的中性盐(NaCl),并用1mol/L氢氧化钠调溶液pH值至溶菌酶的等电区(10.7～11.3),加入少许溶菌酶晶体作晶种,于4℃下静置1～2周,溶菌酶即可慢慢结晶析出,而大多数蛋白质仍存留于溶液之中。结晶体经过滤后将滤液调节至溶菌酶的等电区静置结晶,便得到溶菌酶晶体,可利用重结晶的方法将此结晶体反复精制,直到达到所需要的纯度为止。但是,由于结晶的条件很难获得,所以,其他来源的溶菌酶生产用结晶法较困难；而且由于结晶法成本比较高,生产工艺复杂等原因,其他溶菌酶的生产一般不采用结晶法。另外,结晶法也不适合用以分离微量的溶菌酶。不过, 结晶法目前仍然可以用于提取卵白溶菌酶[11]。
目前,对溶菌酶结晶的研究主要集中在结晶方法的创新、结晶条件的优化、结晶机理的研究和观测方法等方面。结晶方法很多,可分为批量结晶、蒸发扩散结晶(悬滴法P座滴法)、液P液扩散结晶和透析结晶[12]。另外,还有凝胶扩散结晶、水热法及溶剂热法结晶、升华结晶[13-14]和膜结晶[15]等。溶菌酶结晶的常用方法主要是批量结晶和蒸发扩散结晶。近几年,人们尝试用膜结晶法结晶溶菌酶,结果制得了质量较好的适合于衍射分析的溶菌酶晶体。
3.2离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)
离子交换层析法是依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的方法。该法具有快速、分离效果较好,可以重复使用,并能实现大规模自动化连续生产的特点。溶菌酶是一种碱性蛋白质, 最适宜的酸度为pH = 6.5, 因此常选择弱酸性阳离子交换树脂进行分离。目前国内外已经用于溶菌酶分离纯化的离子交换剂主要有724、732型弱酸性阳离子交换树脂,D903、
