瑞士乳杆菌产蛋白酶的培养和提取条件的研究

瑞士乳杆菌产蛋白酶的培养和提取条件的研究张重阳，潘道东＊（南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系，江苏　南京 ２１００９７）摘 要：本文利用正交试验对瑞士乳杆菌ＡＴＣＣ１５０１９产胞内蛋白酶的培养条件及超声波细胞破碎条件进行了研究，得到的优化条件如下：最优培养条件是含０．５％的蔗糖和１％的牛肉蛋白胨的ＭＲＳ改良培养基，初始ｐＨ为　７．４，在３７℃下培养２０ｈ；最佳超声波破碎条件为破碎功率２００Ｗ，破碎时间１０ｍｉｎ。

关键词：蛋白酶；培养条件；破碎条件Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ＨｅｌｖｅｔｉｃｕｓＺＨＡＮＧ　Ｃｈｏｎｇ－ｙａｎｇ，ＰＡＮ　Ｄａｏ－ｄｏｎｇ＊（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，　Ｇｉｎｌｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９７，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ，　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔｓｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ，　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ，　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｒｕｓｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＲＳ　ｃｕｌｔｕｒｅ（０．５％　ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｎｄ　１％　ｂｅｅｆ　ｐｅｐｔｏｎｅ），　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　３７℃，　ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｍｅｄｉａ　ｐＨ７．４，　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ　２０ｈ，ｃｅｌｌｓ　ｓｔａｖｅｄ　ｂｙ　２００ｗ　ｆｏｒ　１０ｍｉｎ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｓｔａｖｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ中图分类号：ＴＱ９２５．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００６）１０－０４１６－０４收稿日期：２００６－０８－１５ ＊通讯作者基金项目：国家自然科学基金（３０５７１３１１）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２００５１３７）；教育部乳品科学重点实验室主任基金作者简介：张重阳（１９８０－），男，硕士研究生，主要从事乳品科学研究。

乳酸菌是人体内的益生菌，长期用于多种发酵食品的加工。

乳酸菌对人体健康的调节作用如调节肠道菌群组成、预防和治疗各种腹泻、免疫调节等已得到广泛的研究和论述，但对其抗高血压功能的研究还处于起步的阶段。

通常认为，乳酸菌的降压作用来自三个方面：其蛋白酶的水解作用、乳酸菌的菌体成分、活菌在肠道内的调节作用。

在众多的乳酸菌中，瑞士乳杆菌有较强的蛋白水解活性，能水解乳蛋白产生多种活性肽。

在瑞士乳杆菌蛋白酶研究方面，Ｙａｍａｍｏｔｏ等从瑞士乳杆菌ＣＰ７９０的培养液中分离到一种蛋白酶，它能将乳中的酪蛋白分解产生抗高血压肽［１］，Ｄｅｇｒａｅｖｅ等从瑞士乳杆菌ＩＴＧＬＨ１菌株的细胞内分离到一种Ｘ－脯胺酰－二肽酰基－氨基肽酶［２］，Ｈｉｒｏｓｈｉ等从瑞士乳杆菌ＬＨＥ－５１１中分离到一种氨基肽酶［３］。

　本文对对瑞士乳杆菌ＡＴＣＣ１５０１９产胞内蛋白酶的培养条件及超声波细胞破碎条件进行了研究。

１材料与方法１．１材料、试剂与设备瑞士乳杆菌ＡＴＣＣ１５０１９（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ１５０１９） 本实验室。

水解酪蛋白、Ｌ－酪氨酸、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、普通蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、酵母浸膏、葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙酸钠等。

７２２可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；ＰＨＳ－３Ｃ型精密ｐＨ计 上海雷磁分析仪器厂；生化培养箱 广东医疗仪器厂；超声波细胞粉碎机 上海新芝生物技术研究所；离心机 北京医用离心机厂。

１．２技术路线 菌种活化 ↓１％接种制备培养基→培养液→离心收集菌体→清洗→超声波破碎→离心取上清液１．３液体培养基的制备蛋白胨１０ｇ、牛肉浸膏１０ｇ、酵母浸膏５ｇ、葡萄糖２０ｇ、吐温８０　１ｇ、磷酸氢二钾２ｇ、乙酸钠５ｇ、柠檬酸三铵２ｇ、水合硫酸镁０．５ｇ、水和硫酸锰０．０５ｇ、蒸馏水１Ｌ、加热溶解、混匀，１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ。

１．４基础培养基中碳源、氮源的优化将ＭＲＳ配方中除碳源、氮源外的药品固定，采用正交试验设计（Ｌ９（３４））优化碳源、氮源。

因素水平表见表１。

表１ 基础培养基碳源、氮源优化正交试验因素水平表(Ｌ９(３４))Table 1 Factors and levels orthogonal test table of the carbonand nitrogen source of basic media水平因素Ａ（０．５％）因素Ｂ（１％）１葡萄糖普通蛋白胨２蔗糖牛肉蛋白胨３乳糖大豆蛋白胨１．５菌体的制备及培养条件的优化［２，３］参考Ｈｉｒｏｓｈｉ（１９９２）的方法，将瑞士乳杆菌活化并制备种子液，以１％接种到８００ｍｌ　ＭＲＳ液体培养基中；菌体在３７℃下培养１６ｈ；培养后在４８００×ｇ下离心２２ｍｉｎ，收集沉淀；并在４８００×ｇ，３０ｍｉｎ离心条件下水洗两次；沉淀加入６ｍｌ　０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．５的磷酸缓冲液溶解制得菌液。

根据温度、时间及ｐＨ值等单因素实验结果，选取适当条件进行正交试验设计（Ｌ９（３４））优化。

１．６酶液制备及超声波破碎条件的优化［４，５］将上述菌液进行破碎处理，破碎条件如下：冰浴，功率２００Ｗ，破碎２００次，每次破碎时间３ｓ，中间间隙时间３ｓ。

破碎后的溶液经４８００×ｇ离心３０ｍｉｎ，收集其上清液即酶液。

根据破碎功率及破碎时间的单因素试验，选取适当条件对两者采用正交试验设计（Ｌ９（３４））优化破碎条件。

１．７菌液吸光值的测定用７２２可见光分光光度计在６００ｎｍ下比色，测定菌液吸光值（ＯＤ值）。

表２ 培养条件优化正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test of culture conditions试验序号Ａ时间（ｈ）Ｂ温度（℃）Ｃ　ｐＨ值Ｄ误差 指标ＯＤ６００蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）蛋白含量（ｍｇ／ｍｌ）酶比活力（Ｕ／ｍｇ）１１２３０６．４１０．８９６５．１１２９２．３２４４２．１９９６２１２３７６．９２１．０１１５．７８４８２．６６５２．１７０６３１２４２７．４３０．８９５７．３３８６２．４７６５２．９６３２４１６３０６．９３０．９４８６．２０４７２．２４８４２．７５９６５１６３７７．４１１．０７６５．３２２８２．５４６０２．０９０７６１６４２６．４２０．７８１４．３１５０２．４７９８１．７４００７２０３０７．４２１．０３６５．１５４９２．２１５３２．３２６９８２０３７６．４３１．０２６４．２３１０２．１９２２１．９３００９２０４２６．９１０．８６４．４４１０１．８１５２２．４４６５图１ 培养时间对测定指标的影响Fig.1 Effect of culture time on measured indexes时间（ｈ）ＯＤ６００酶活力（Ｕ／ｍｌ）蛋白含量（ｍｇ／ｍｌ）比活力（Ｕ／ｍｇ）１．８蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定采用《酶制剂工业》（下）中的方法［６］。

１．９蛋白含量的测定采用南京建成生物工程研究所提供的总蛋白定量测定试剂盒（考马斯亮兰法）测定。

２结果与分析２．１培养时间对测定指标的影响培养时间对菌液的吸光值、蛋白酶活力、蛋白含量及酶比活力的影响见图１。

由图１可以看出，菌液的ＯＤ６００值在１６ｈ达到峰值，反映出培养基内细菌数达到最高；胞内蛋白酶活力同时到达峰值，并在此后出现小幅回落；胞内蛋白含量在６ｈ后基本持平；酶的比活力也在１６ｈ附近达到峰值。

由此可见，细菌在培养１６ｈ以后提取胞内蛋白酶较合适。

２．２培养条件优化正交试验的结果由表２、表３可知，在培养温度、时间及ｐＨ优化正交实验中，对菌液ＯＤ６００值来说，最优组合是Ａ１Ｂ１Ｃ３Ｄ３；对胞内蛋白酶活力来说，最优组合为Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ３；对胞内蛋白含量来说，最优组合是Ａ１Ｂ２Ｃ３Ｄ２；对蛋白酶比活力来说，最优组合是Ａ１Ｂ１Ｃ３Ｄ３；　三个因素对于四个检测指标影响的大小也不完全同，对ＯＤ６００和胞内蛋白含量影响最大的是培养时间，对酶比活力影响最大的是培养基初始ｐＨ；对胞内蛋白酶活力影响最大的是培养温度，ｐＨ次之，培养时间影响最小。

在ＯＤ６００值最大时并未得到较多的胞内蛋白酶，说明胞内蛋白酶活力并不与菌体多少成正比，而与菌体的培养条件有一定的关系。

胞内蛋白与蛋白酶活力最高值不在同一条件出现，说明胞内蛋白酶的活力并不与胞内总蛋白含量完全一致。

试验表明，提取胞内蛋白酶的最优组合是Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ３，即２０ｈ、３７℃及ｐＨ７．４。

２．３基础培养基中碳源、氮源的优化结果按表１中的条件进行正交试验，结果如表４所示。

由表４、表５可知，在碳源、氮源优化正交实验中，对菌液ＯＤ６００值来说，最优组合是Ａ２Ｂ１Ｃ２；对胞内蛋白酶活力来说，最优组合为Ａ２Ｂ２Ｃ２；对胞内蛋白含量来说，最优组合是Ａ１Ｂ２Ｃ１；对蛋白酶比活力来说，最优组合是Ａ１Ｂ３Ｃ３；对于四个检测指标的影响均是Ａ＞Ｂ，即碳源的影响为主。

在ＯＤ６００值最大时并未得到较表５ 基础培养基优化的正交试验极差及显著性分析结果Table 5 Results of range and significance analyses of orthogonal test for optimizing conditions of basic mediaＯＤ６００蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）蛋白含量（ｍｇ／ｍｌ）酶比活力（Ｕ／ｍｇ）ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣｋ１１．０６０１．１３７１．０９５４．１３３３．２８６２．８１０３．９７０３．５５３３．６７３３．２１２０．９０１０．７４７ｋ２１．２２８１．０４３１．１０８４．２０３３．７６９３．８３２３．６５６３．６３８３．６００１．１５７１．０１２１．０２７ｋ３０．８５５１．０６３１．０４０１．４２４２．７０５３．１１８３．１８５３．６２１３．５３８０．４５３２．９０８３．０４８Ｒ０．３７３０．０９４０．０６８２．７７９１．０６４１．０２２０．７８５０．０８５０．１３５２．７５９２．００７２．３０１显著性＊＊表３ 培养条件优化的正交试验的正交试验极差分析结果Table 3 Analysis of orthogonal test of culture conditions ＯＤ６００ 蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ） 蛋白含量（ｍｇ／ｍｌ） 酶比活力（Ｕ／ｍｇ）ＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤｋ１６．０７９５．４９１４．５５３４．９５９０．９３４０．９６００．９０１０．９４４２．４８９２．２６３２．３３２２．２２９２．４４４２．４２９１．９５７２．２４６ｋ２５．２８１５．１１３５．４７７５．０８５０．９３５１．０３８０．９４００．９４３２．４２５２．４６８２．２４３２．４５３２．１９７２．０６４２．４５９２．０７９ｋ３４．６０９５．３６５５．９３９５．９２５０．９７４０．８５４１．００２０．９５６２．０７４２．２５７２．４１３２．３０６２．２３４２．３８３２．４６０２．５５１Ｒ１．４７００．３７８１．３８６０．９６６０．０４００．１９３０．１０１０．０１３０．４１５０．２１１０．１７００．２２４０．２４７０．３６５０．５０３０．４７２表４ 基础培养基碳源、氮源优化正交试验结果(Ｌ９(３４))Table 4 Results of orthogonal test of the carbon and nitrogen source of basic media试验序号Ａ碳源（０．５％）Ｂ氮源（１％）Ｃ误差 指标ＯＤ６００蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）蛋白含量（ｍｇ／ｍｌ）酶比活力（Ｕ／ｍｇ）１１１１１．１５９４．０４１９３．８３９２１．０５２８２１２２１．１９９５．４４８８４．０５３９１．３４４０３１３３１．１２３２．９０８１４．０１７５７．２３８６４２１２１．３３３４．２７２９３．６９７２１．１５５７５２２３１．０７８４．９０２８３．４７５２１．４１０７６２３１１．２７４３．４３３０３．７９５５０．９０４５７３１３０．９２１．５４３３３．１２２３０．４９４２８３２１０．８５２０．９５５３３．３８４３０．２８２２９３３２０．７９３１．７７４２３．０４９５０．５８１８多的胞内蛋白酶，说明胞内蛋白酶活力并不与菌体多少成正比，而与培养基的组成有一定的关系。