食品微生物实验

一、简单染色法:
1、涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑1-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2
整个过程中要注意无菌操作。

（示范无菌操作技术）
2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方温火烘干，切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

4、染色：将固定过的涂片加适量草酸铵结晶紫染色1-2min。

5、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6、干燥：涂片放在空气中晾干或用吸水纸轻轻吸干，。

7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

8、绘图：
9、实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。

b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。

c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。

注意擦镜头时向一个
方向擦拭。

②各部分还原，将电源灯亮度调至最低后关闭，将最低放大倍数的物镜转到工作位置，同时将载物台降到最低位置
③看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

二、革兰氏染色（X）
1.制片：分别涂片、晾干和固定。

2.初染：将玻片置于废液缸玻片搁架上，滴加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1～2min，水洗（倾去染色液，用水小心地冲洗）。

3.媒染：滴加碘液，媒染1min，水洗。

4.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～30s
至流出液无色，立即水洗
5.复染：滴加沙黄复染液,复染2 ～3min，水洗、晾干。

6.镜检：低倍—高倍—油镜
三、细菌芽孢染色法及观察
1、制片：按常规方法制作涂片、干燥、固定。

2、染色：
①加染色液：加5%孔雀绿染色液于涂片处，然后将玻片放在玻片搁架上，再将搁架放
在三角铁架上，用微火加热至染料冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。

加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。

②水洗：待玻片冷却后，用洗瓶中的自来水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为
止。

③复染：用沙黄染色2min。

④水洗：蒸馏水冲洗，吸干。

3、镜检：低倍—高倍—油镜。

四、酵母菌大小及数量测定(X)
一）细胞大小测定
1、对目镜测微尺的校正
镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上（目镜测微尺已在镜筒中），在高倍镜下进行目镜测微尺校正。

2、细胞大小的测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。

调节显微镜光圈，用目镜测微尺测量细胞直径。

（二）细胞数量测定
1.取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。

2.取酵母菌稀释液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数
室内不得有气泡。

3.静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央计数室。

4.在高倍镜下计数：随机计数五个中格的菌数，然后求得每个中格的平均值。

乘上16(或
25)就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。

5. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。

五、放线菌(X)
1、倒平板：将培养基融化后，冷却至50°C左右，倒20mL左右于灭菌培养皿内，凝固后使用
2、插片：用无菌镊子取无菌盖玻片，插在平板培养基上（40°-50°插入）
3、接种与培养：用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，28°C培养7d
4、观察：在载玻片中央滴一滴0.1%美兰，小心用镊子将盖玻片抽出，带菌面朝下，覆盖于染色液上，浸泡2min后，用吸水纸将多余染色液吸干，镜检:低-高
六、霉菌
1、水浸片制法：
A. 先观察霉菌的菌落形态;
B. 于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉兰液于载片中央；
C. 用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液滴中；
D. 再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡
2、置于低倍镜下观察，必要时换高倍镜。

七、配制培养基
1.固体培养基：牛肉膏3g. 蛋白胨10g. NaCl 5g. 琼脂
14g .PH值7.2~7.4 .水1000ml。

半固体培养基：牛肉膏3g. 蛋白胨10g. NaCl 5g. 琼
脂5g . PH值7.2~7.4 .水1000ml。

2.灭菌生理盐水
含0.85% NaCl的蒸馏水灭菌。

3.高压灭菌
121℃，20min（生理盐水，培养基）
4.搁斜面，倒平板
称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。

溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（杯中有刻度），玻棒搅匀，加热溶解。

加琼脂粉：加热过程中要不断搅拌，完全沸腾后补水至刻度。

调pH值：用1Mol/l NaOH溶液调节到7.2~7.4用pH试纸对照。

分装：利用移液器（待液体温度稍降再倒入）分装培养基与生理盐水，用完立即清洗，注意不要污染塞子。

（若移液器针头够不着就用移液管）。

进行包扎，贴上标签，注明何种培养基，时间，班级。

灭菌备用：121℃，30min高压蒸汽灭菌。

高压锅灭菌步骤及注意事项
1.灭菌器内加水到水位线（注意加水要加够，防止灭菌过程中干锅）灭菌材料放好后，关
闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖螺栓。

2.接通电源，打开排气阀，进行加热，待水煮沸以后，水蒸气和空气一起排出，当排出大
量水蒸气时，持续3min，关闭排气阀，排除高压锅内的冷空气。

3.随着锅内压力的上升，水的沸点升高（>100℃）压力达0.1MPa（即1.05kg/cm2）时，温
度121℃，持续15~30min 。

4.待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。

八、细菌分离与接种
（一）斜面接种
1、在斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者；
2、点燃煤气灯；
3、将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平状态，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。

4、右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指/小指和无名指分别夹持试管帽，将其取出，并迅速烧灼管口。

5、将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。

将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，自然面底部开始向上作“Z”型划线接种，即将环上的菌体在作有规则划线中涂布与斜面表面，然后抽出接种环，同时将两支或3支试管口语棉塞一次过火，最后塞在各自的试管上。

6、杀灭环上残留菌
7、培养：37°C，24h
（二）穿刺接种
用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底，
但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管
塞，烧灼接种针。

（三）稀释涂布平板法
1.倒平板：制备牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌，冷却至55-60℃。

右手手掌夹住瓶塞，然后持盛培养基三角瓶放置火焰旁边，瓶口过火焰三次，左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置与桌面上，待凝后即为平板。

2.制备土壤稀释液：用一支1mL无菌吸管吸取0.5mL菌悬液加入4.5mL无菌水的试管中充分混匀，此为10-2稀释液，以此类推制成10-6、10-7、10-8梯度稀释液。

3、滴加菌液：从10-6、10-7、10-8、各管中分布吸出0.2mL菌液到相应编号的平板表面上，每个稀释度2个平行。

4、涂布平板：左手执培养皿，并将皿盖开启一缝，右手拿涂布玻棒把平板上的一滴菌液轻轻涂开、均匀铺满整个平板，并防止平板培养基破损。

（四）平板划线分离法
1、挑取菌落：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。

2、先划A区：将平板倒置于煤气灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。

右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地
3、划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区而移至B区，随即在B区轻巧地划上6-7条致密的平行线，接着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条和A区平行，最后，合上皿盖，并烧去接种环上的残菌。

划3-4条连续的平行线当做初步稀释的菌源。

烧去接种环上的残余菌样。

九、菌落总数测定
1.采水样
取距离水面10~15cm深层水样于灭菌三角瓶中。

2.菌落总数的测定：
水样稀释。

稀释液加入平皿，每个稀释度做2个平行。

倾注接种培养。

凝固后37℃，倒置培养24h。