金属硫蛋白对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响.
- 格式：pdf
- 大小：609.21 KB
- 文档页数：4
收稿日期:2006211215;修回日期:2007204211
作者单位:1.430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科;2.武汉市中心医院神经内科通讯作者:濮德敏,E2mail:hongxiu1980@yahoo.com.cn
作者简介:李天(19802),女,博士在读,主要从事妇科疾病与肿瘤研究
金属硫蛋白对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响李 天1,熊 维2,濮德敏1,汪 辉1EffectsonProliferationandApoptosisinHumanCervicalCancerCellsTreatedwithMetallothioneinLITian1,XIONGWei2,PUDe2min1,WANGHui11.DepartmentofObstetricsandGynecology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China;2.DepartmentofNeurology,TheCen2tralHospitalofWuhanCorrespondingAuthor:PUDe2min,E2mail:hongxiu1980@yahoo.com.cn
Abstract:Objective TostudytheeffectsofmetallothioneinontheproliferationandapoptosisofhumancervicalcellHeLaandtheirinitiatorymechanism.Methods AddMTofdifferentconcentrationtoHeLacell,MTTassaywasusedtoanalyzeproliferativerateandapoptosiswasmeasuredbyflowcytometry,immunocytochemistryandRT2PCRwereusedtodetectexpressionofp53andPCNA.Results (1)Met2allothioneinexertedproliferationeffectonHeLacellinaconcentration2dependentwayandtheeffectwasmostobviouslyin1ng/ml(P<0.05).(2)ApoptosiswasinhibitedbyMT,andAIwas6.35±1.08
、
4.45±0.95and2.15±0.77whenMTwason0、0.01and1ng/ml.(3)Theexpressionofp53wassig2nificantlydecreasedandPCNAwassignificantlyincreasedafterMTtreatment,andtheeffectswerecon2centration2dependent.Conclusion Metallothioneincanenhanceproliferationandinhibitapoptosisofhu2mancervicalcellHeLa,maybethroughinhibitingtheexpressionofp53gene.Keywords:Metallothionein;Cervicalcancer;Cellproliferation;Apoptosis摘 要:目的 探讨金属硫蛋白(metallothionein,MT)对人宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响并初步分析其机制。方法 以不同浓度的MT(0.001、0.01、0.1和1ng/ml)干预HeLa细胞,MTT法测定其对细胞增殖的促进作用,流式细胞仪分析凋亡率,免疫细胞化学法和RT2PCR法测定p53和PCNA的表达。结果 (1)MT对HeLa细胞增殖表现出浓度依赖性的促进作用,以1ng/ml时作用最明显(P<
0.05)。(2)MT可抑制细胞凋亡,其浓度为0、0.01和1ng/ml时,凋亡指数(AI)分别为(6.35±1.08)%、(4.45±0.95)%和(2.15±0.77)%。(3)MT作用后细胞p53表达显著减弱,PCNA表达显著增强,两者均呈浓度依赖性。结论 MT对人宫颈癌HeLa细胞具有显著地促进增殖和抑制凋亡作用,
其机制可能与抑制p53基因表达有关。关键词:金属硫蛋白;宫颈癌;细胞增殖;细胞凋亡中图分类号:R737.31 文献标识码:A 文章编号:100028578(2007)1220924203
0 引言近年越来越多的研究显示,金属硫蛋白(metal2lothionein,MT)与肿瘤的发生、发展、种植、转移等密切相关,在许多恶性肿瘤组织中都证实有MT的高表达[1,2]。我们以往的研究证实,在宫颈癌组织中普遍存在MT的显著高表达,且其表达水平与细胞增殖核抗原(PCNA)的表达呈正相关,与细胞凋亡率呈负相关。本文以宫颈癌细胞系HeLa为研究对象,观察不同浓度的MT对宫颈癌细胞系细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响,进一步探讨MT在宫颈癌发病机制中的作用。
1 材料与方法1.1 实验材料人宫颈癌细胞系HeLa由本科实验室保存,
RPMI21640培养基、高糖DMEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品,MTT购自AMRESCO公司,MT购自惠州赛特公司,鼠抗人PCNA、p53单克隆抗体为北京中杉公司产品,碘化丙啶(PI)购自Sigma公司,PCR引物由上海生工合成,Trizol购自Invitrogen公司,RT2PCR相关试剂购自TIANGEN公司。其他均为国产分析纯试剂。
・429・肿瘤防治研究2007年第34卷第12期1.2 细胞培养HeLa细胞用含10%小牛血清的RPMI21640
完全培养基,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,每3
天传代1次。1.3 MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞,按每孔3×105个细胞接种于4块96孔板中。接种24h后,加入不同浓度的MT(终浓度分别为0.01、0.1、1、5ng/ml),每个浓度设5个复孔,对照组不加MT。分别在MT处理后12、24、48和72h时加入MTT,继续培养4h后,弃上清,加入二甲基亚砜(DMSO),震荡10min后在酶标仪上测定各孔吸光度值(A
570
)。细胞增殖率
(%)=(实验组A570值/对照组A570值21)×100%。
1.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡率HeLa细胞以5×105/ml接种于6孔板中,加入终浓度分别为0.01、0.1、1ng/ml的MT,培养24h后收集细胞,制成单细胞悬液,经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,70%预冷乙醇-20℃固定过夜。加
入含有RNase的0.05%PI染液,4℃避光染色30
min后,流式细胞仪(美国BD公司产品)分析细胞周期和凋亡率。以含亚二倍体DNA细胞视为凋亡细胞,Cellquest软件分析结果。凋亡指数(AI)(%)=亚二倍体峰细胞数/总细胞数×100%。
1.5 免疫细胞化学取对数生长期的细胞常规胰酶消化,接种于铺有盖玻片的24孔板中,细胞贴壁后,加入终浓度分别为0.01、0.1、1ng/ml的MT,培养24h后弃培养基,95%乙醇固定30min,进行免疫细胞化学染色。3%H2O2去除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭后,加p53、PCNA一抗4℃孵育过夜,以PBS代替一抗为阴性对照。然后依次加二抗、三抗孵育,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明后中性树胶封片,镜下观察,用图像分析软件测量染色的积分光密度(OD)。1.6 RT2PCR
经不同浓度MT处理的细胞总RNA提取按Trizol说明书进行。引物序列为:p53上游:5′2TC2CAAGTGTCAGCTCCTGCA23′,下游5′2GAAGATTCCCACTGGAGTCT23′,扩增产物213bp;G3PDH上游:5′2GGTCGGAGTCAACGGATTT2GGTCG23′,下游:5′2CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC23′,扩增产物788bp。逆转录合成cDNA后,进行PCR扩增,反应条件为:94℃5min、94℃45s、55℃45s、72℃1min,共32个循环;72℃10min;4℃保持。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察并拍照。每组实验至少重复3次,运用MUVB-20
凝胶成像分析系统测定各条带的灰度
值,基因表达强度按目的条带与G3PDH条带的比值计算。1.7 统计学处理应用SPSS12.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验,组间比较采用单因素方差分析,以P
<0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 不同浓度MT对HeLa细胞增殖的影响MT促进HeLa细胞增殖作用呈浓度依赖性,低浓度时随浓度增加促增殖作用增强,至浓度为1ng/ml时作用最明显(P<0.05),而5ng/ml时作用减弱。从作用时间上观察,MT作用24h时细胞增殖率明显高于12h时,作用48h时细胞增殖率介于两者之间,72h时最低,差异均有统计学意义(P
<0.05),见图1。
图1 不同浓度MT对HeLa细胞增殖的影响2.2 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率MT可明显抑制HeLa细胞凋亡,且随MT浓度增加,凋亡率呈逐渐下降趋势。MT浓度为0、0.01、0.1及1ng/ml时,AI值依次为(6.35±1.08)%、(4.45±0.95)%、(4.87±1.35)%和(2.15±0.77)%。1ng/ml组与低浓度组及对照组(0ng/
ml)比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2。2.3 MT对HeLa细胞p53、PCNA蛋白表达的影响随MT浓度的增加,宫颈癌HeLa细胞p53蛋白表达水平逐渐降低,PCNA蛋白表达水平逐渐增加,见表1、图3。2.4 MT对HeLa细胞p53mRNA表达的影响随着MT浓度的增加,宫颈癌HeLa细胞p
53
mRNA表达逐渐减少,对照组、MT0.01ng/ml组、MT0.1ng/ml组、MT1ng/ml组灰度比值依次为(1.27±0.35)、(0.95±0.22)、(0.82±0.14)和
(0.34±0.15),1ng/ml组与低浓度组及对照组比
较,差异均有统计学意义(P<0.05),见图4。
・529・肿瘤防治研究2007年第34卷第12期
