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酶工程思考题汇总第一章P251．何谓酶工程?试述其主要内容和任务.酶的生产，改性与应用的技术过程称为酶工程。
主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2．酶有哪些显著的催化特性？专一性强（绝对专一性——钥匙学说、相对专一性——诱导契合学说）、催化效率高、作用条件温和3．简述影响酶催化作用的主要因素.底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素第二章P635．酶的生物合成有哪几种模式？生长偶联型（同步合成型、中期合成型）、部分生长偶联型（延续合成型）非生长偶联型（滞后合成型）7．提高酶产量的措施主要有哪些？a.添加诱导物（酶的作用底物、酶的催化反应物、作用底物的类似物）b.控制阻遏物的浓度c.添加表面活性剂d.添加产酶促进剂11．固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点？1.提高产酶率2.可以反复使用或连续使用较长时间3.基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4.发酵稳定性好5.缩短发酵周期，提高设备利用率6.产品容易分离纯化7.适用于胞外酶等细胞产物的生产第三章P843．植物细胞培养产酶有何特点？1.提高产率2.缩短周期3.易于管理，减轻劳动强度4.提高产品质量5.其他4．简述植物细胞培养产酶的工艺过程。
外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物6．动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？1.培养基的组成成分2.培养基的配制3.温度的控制4.ph的控制5.渗透压的控制6.溶解氧的控制第四章P1351．细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？机械破碎法：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎（捣碎法，研磨法，匀浆法）物理破碎法：通过物理因素的作用（温度差破碎法，压力差破碎法，超声波破碎法）化学破碎法：通过化学试剂对细胞膜的作用（添加有机溶剂，添加表面活性剂）酶促破碎法：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏（自溶法，外加酶制剂法）2．试述酶提取的主要方法。
酶的非水相催化考研考点总结●水相酶反应的限制●仅限于水溶性底物●大部分有机物在水中溶解性差●水会引发副反应或造成产物分解●不利于反应平衡向产物推进●产物回收困难●非水相催化的优势●增加非极性底物的溶解度●使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如肽的合成、酯的合成等●可减少在水相容易发生的副反应，如酸酐的水解、卤化物的水解等●容易分离回收●无微生物污染●相关问题●非水相并不代表完全无水，完全无水的情况下酶是无活性的●极性较强的溶剂可能剥离掉酶分子中必须的水，导致酶失活；而疏水性溶剂对水的溶解能力较低●在无水溶剂中，酶蛋白分子的刚性增加，空间构象较难发生改变●非水相催化的类型●有机介质中的酶催化●气相介质中的酶催化●超临界流体介质中的酶催化●离子液介质中的酶催化由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类●非水相催化的体系●与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系●（正）胶束体系●反胶束体系●与水溶性有机溶剂组成的均一体●微水介质体系●酶非水相催化的影响因素●水●水对酶分子构象的影响酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象●水对酶催化反应速度的影响●水活度在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高●有机溶液●有机溶剂对酶结构与功能的影响在有机溶剂中，酶分子（经过修饰后可溶于有机溶剂者除外）不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应●有机溶剂对酶分子表面结构的影响●有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响溶剂有可能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点●有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水●有机溶剂对底物和产物分配的影响●酶的催化特性●底物专一性可能受影响●对映体选择性●区域选择性酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应●健选择性●热稳定性更好●pH值特性：pH记忆●非水相催化条件的控制●水含量●酶的选择●底物的选择和浓度控制●有机溶剂的选择●温度控制。
摘要非水相中的酶促酯交换反应广泛应用于油脂的改性。
该反应通过酯交换替换甘三酯中的酰基基团来改善油脂性质。
生物柴油作为一般石化燃料的良好替代品，其发展前景被世界发达国家普遍看好。
本论文从降低生产成本和提高生物柴油品质的角度出发，采用无溶剂系统作为反应体系，利用脂肪酶催化菜籽油与甲醇进行酯交换反应制取生物柴油，简单探讨了生物柴油中甘油含量的测定方法和脂肪酶促酯交换制取生物柴油的反应条件。
采用萃取的方法从生物柴油中提取甘油，用高碘酸钠氧化法对甘油含量进行测定，证明了该方法对甘油含量测定的准确性。
进而又尝试了采用分批加入甲醇的方法来制取生物柴油，发现此法比一次性加入全部甲醇有更高的反应转化率，但是在反应历程的实验中，分批加入甲醇的方法还有待完善。
关键词：无溶剂系统；菜籽油；脂肪酶；酯交换反应；生物柴油ABSTRACTEnzymatic interesterification in non-aqueous phase has been widely used for improving the quality of oil and fats. This reaction provides a useful alternative for replacing the acyl group of glycerides to modify oil and fats. Biodiesel is a good substitute for Petrochemical fuel, and developed country realize that it has good Development foreground. To reduce the product cost and improve the quality of Biodiesel, lipase-catalyzed interesterification of Vegetable oil with Methyl alcohol for Biodiesel production in a solvent free system was explored in this dissertation. The analytical method of Glycerin in Biodiesel and the optimization of reaction conditions were investigated systematically.Glycerin could be extracted from Biodiesel by extraction. And it could be analysised by Sodium Periodata oxidimetry. The accuracy of it has been proved. Trying to join Methyl alcohol by several times in Biodiesel production, we found it was more effective than joining Methyl alcohol by one time. But it need to be improved in the experiment of reaction process.Keywords: Solvent free system; Vegetable oil; Lipase; Interesterification; Biodiesel目录摘要 (Ⅰ)ABSTRACT (Ⅱ)第一章绪论 (1)1.1 生物柴油研究进展 (1)1.1.1 生物柴油的化学组成及物理特性 (1)1.1.2 生物柴油生产研究状况 (1)1.1.3 生物柴油的制备方法 (2)1.1.4 生物柴油生产原料 (4)1.2 生物催化与有机合成 (4)1.3 非水相酶学 (5)1.3.1 非水相酶学的兴起 (5)1.3.2 非水相酶催化的优点 (5)1.3.3 无溶剂系统 (6)1.4 脂肪酶的研究与应用 (6)1.4.1 脂肪酶的研究概况 (6)1.4.2 脂肪酶的催化机制 (7)1.4.3 脂肪酶的底物特异性 (7)1.4.4 脂肪酶在油脂工业中的应用 (8)1.5 菜籽油的研究与应用 (9)1.5.1 菜籽油的性质及组成 (9)1.5.2 菜籽油的工业用途 (9)1.5.3 菜籽油甲酯化 (10)1.6 脂肪酶促酯交换反应 (10)1.6.1 脂肪酶促酯交换反应的催化机制 (10)1.6.2 菜籽油酶促酯交换生产生物柴油 (11)1.6.3 反应体系含水量的影响 (11)第二章材料与方法 (13)2.1 实验材料 (13)2.1.1 脂肪酶 (13)2.1.2 主要试剂及原料 (13)2.2 仪器设备 (13)2.3 实验方法 (14)2.3.1 试剂的配制 (14)2.3.2 酸度计的校准 (14)2.3.3 游离甘油含量测定 (15)2.3.4 总甘油含量测定 (15)第三章甘油含量标准曲线的绘制 (17)3.1 水中游离甘油测定方法研究 (17)3.2 菜籽油中游离甘油含量标准曲线的绘制 (18)小结 (19)第四章脂肪酶酯交换制取生物柴油的研究 (20)4.1 菜籽油中总甘油含量测定 (20)4.2 甲醇的添加对酯交换反应的影响 (21)4.3 生物柴油反应历程实验 (21)小结 (23)结论与展望 (24)参考文献 (25)致谢 (30)第一章绪论1.1 生物柴油研究进展1.1.1 生物柴油的化学组成及物理特性柴油分子是由15个左右的碳链组成的,研究发现植物油分子则一般由14～18个碳链组成,与柴油分子中碳数相近。
⏹第八章非水相酶催化⏹概述酶催化反应的介质⏹第一节有机介质中的酶促反应概述⏹第二节有机介质中酶促反应的条件⏹第三节有机介质对酶性质的影响⏹第四节有机介质中酶促反应应用举例⏹酶催化反应的介质⏹酶非水相催化的几种类型⏹酶非水相催化的几种类型⏹第一节有机介质中的酶促反应概述⏹一．有机相酶反应的优点：⏹二．有机相酶反应具备条件⏹三．有机相酶反应的研究进展⏹四．有机相酶反应的应用现状⏹一．有机相酶反应的优点：⏹1．有利于疏水性底物的反应。
⏹2．可提高酶的热稳定性，扩大反应pH值的适应性。
⏹3．可改变反应平衡移动方向,能催化在水中不能进行的反应。
Eg:脂肪酶在水中催化油脂水解，有机溶剂中催化酯化、转酯化、氨解多种反应。
P179(2)⏹一．有机相酶反应的优点：⏹4．可控制底物专一性，可防止由水引起的副反应。
Eg：酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移。
P179(3)⏹5．酶易于实现固定化。
⏹6．酶和产物易于回收。
（低沸点溶剂更易分离纯化产物)⏹7．可避免微生物污染。
⏹有机介质反应体系⏹一、非极性有机溶剂−酶悬浮体系(微水介质体系)用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。
但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。
酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。
⏹二、与水互溶的有机溶剂−水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。
酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。
⏹三、非极性有机溶剂−水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。
⏹反应体系中水对酶催化反应的影响⏹酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。
所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。
有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
⏹酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。
在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。
故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。
维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。
⏹有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。
存在最适水含量。
⏹二．有机相酶反应具备条件⏹1．保证必需水含量。
⏹2．选择合适的酶及酶形式。
⏹3．选择合适的溶剂及反应体系。
⏹4．选择最佳pH值。
⏹三．有机相酶反应的研究进展⏹1．超临界流体中的酶反应⏹2．仿水溶剂和印迹技术⏹1．超临界流体中的酶反应⏹超临界流体的概念:⏹指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。
⏹超临界流体的有关性质⏹（1）超临界流体的P-V-T性质⏹超临界流体的有关性质⏹（2）所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa)时的状态。
该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。
⏹超临界流体的有关性质⏹（3）提高溶剂选择性的基本原则是：⏹第一：操作温度和超临界流体的临界温度接近；⏹第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化⏹学性质接近。
⏹超临界流体萃取的应用实例⏹2．仿水溶剂和印迹技术⏹（1）仿水溶剂体系⏹（2）分子印迹技术⏹（1）仿水溶剂体系⏹原理:⏹可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。
⏹应用举例：⏹通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。
⏹（2）分子印迹技术⏹ e.g. 1⏹当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。
⏹分子印迹技术原理：⏹竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
⏹酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。
⏹第一节结束优点具备条件研究进展应用现状⏹第一节结束⏹点击返回⏹第二节有机介质中酶促反应的条件⏹一．必需水⏹二．酶的选择⏹三．溶剂及反应体系的选择⏹四．pH选择和离子强度的影响⏹一．必需水⏹概念：⏹紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。
⏹一．必需水⏹⏹ 2 ．干燥的酶水合过程：⏹（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）⏹（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)⏹（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25~0.38g/g）⏹（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。
⏹3．影响酶反应体系中需水含的因素a．不同酶需水量不同b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少⏹胰脂肪酶活性与含水量的关系⏹4．表征必需水作用的参数---热力学水活度⏹即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。
该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。
⏹二酶的选择⏹ 1 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。
⏹除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。
⏹2．酶形式的选择⏹（1）酶粉：⏹例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。
⏹二．酶的选择⏹（２）化学修饰酶：⏹例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。
⏹二．酶的选择⏹（３）固定化酶：⏹把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。
⏹三．溶剂及反应体系的选择⏹水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等⏹水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等⏹1．酶促反应有机介质体系⏹（1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）⏹（２）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）⏹（３）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）⏹（４）反胶束体系☆⏹ A.反胶束体系概念⏹反胶束体系：⏹是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。
反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。
⏹概念表面活性剂⏹表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。
⏹在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：⏹AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。
⏹概念临胶束浓度⏹临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。
⏹CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。
⏹概念⏹正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。
⏹反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。
⏹ B.反胶束体系的制备⏹将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。
⏹反胶束体系的制备⏹影响因素⏹反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。
⏹反胶束体系中的含水量⏹反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。
Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。
⏹C．基本原理：“水壳”模型⏹反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。
结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水；⏹自由水即为存在于水相中的那部分水。
⏹“水壳”模型⏹水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。
⏹ 1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层。
⏹ 2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。
⏹ 3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。
⏹D．影响的主要因素⏹水相pH值的影响⏹离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定⏹表面活性剂浓度的影响⏹离子种类对萃取的影响⏹双水相体系将头孢立新得率提高3倍⏹2．有机溶剂影响酶催化的方式⏹（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活⏹2．有机溶剂影响酶催化的方式⏹（2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活⏹3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。
⏹3．选择有机溶剂必须考虑因素⏹(1). 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。
)⏹相容性⏹例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）⏹(2). 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。
⏹例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。
⏹(3)必须考虑的其他因素⏹溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）⏹溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。
⏹生物催化剂的环境调控技术⏹四．PH选择和离子强度的影响⏹（1）pH选择：⏹在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。
酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。
⏹（2）离子强度影响⏹随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。
⏹第二节结束必需水酶的选择溶剂及反应体系pH选择和离子强度⏹第二节结束⏹点击返回⏹第三节有机介质对酶性质的影响⏹一、稳定性⏹二、活性⏹三、专一性⏹四、反应平衡方向⏹一、稳定性⏹（１）热稳定性提高⏹（２）储存稳定性提高⏹一、稳定性⏹结论⏹在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；⏹一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；⏹含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。
⏹二活性⏹刚-柔并存⏹刚性：生物大分子结构的精确性⏹柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。
⏹二、活性⏹1、单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响⏹（1）有机溶剂直接作用于酶⏹（2）有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。
