牛流行热病毒山东流行株G基因的克隆及序列分析

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解猫细小病毒（FPV ）在国内的流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究对采集的30份疑似感染FPV 的肛拭子进行检测，利用常规方法从中分离并鉴定出3株FPV 。

然后扩增出3株FPV 的VP2基因，利用DNAstar 等软件将获得的VP2基因与国内外报道的流行株和疫苗株的VP2基因序列进行比对和遗传进化分析。

研究结果显示，本文分离的3株FPV 均能在猫肾细胞中良好增殖，并产生典型致细胞病变（CPE ），在电子显微镜下呈现典型的细小病毒形态特征。

序列比对结果显示，此3株FPV 的VP2序列与国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.6%~99.8%和98.5%~99.8%；与疫苗株的VP2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%~99.4%和99.1%~99.5%；进化树分析结果显示，本研究分离的FPV 与国内流行株及疫苗株均具有较近的遗传距离，并处于同一拓朴群，但是SH612株和ZZ6293株与疫苗株的距离稍微远些，处于不同的拓朴亚群。

本文研究结果丰富了中国FPV 的流行病学资料，为进一步研发FPV 疫苗提供了参考资料。

关键词：猫细小病毒；VP2；序列同源性；遗传进化中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）02-0086-07Isolation, Identifi cation and Genetic Evolution Analysis of Three Feline Parvovirus StrainsTANG Aoxing 1, LIU Chuncao 1, WANG Zhenzhen 1,2, MENG Chunchun 1, ZHU Jie 1, TANG Jingyu 1,LI Chuanfeng 1, GUO Hongyuan 1, SONG Xinyu 3, LIU Guangqing 1(1. Small Animal Infectious Disease Prevention and Control Innovation Team, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Xinjiang Agricultural University, Xinjiang 830052, China; 3. State Key Laboratory of Animal Genetic EngineeringVaccine, Qingdao 266114, China)收稿日期：2021-06-29基金项目：上海市科技兴农项目（沪农科创字（2019）第3-3号）；国家重点研发计划项目（2016YFD0500108、2016YFD0501003）；上海市科技兴农创新项目（沪农科创字(2019)第3-3号）；动物基因工程疫苗国家重点实验室开放课题（AGVSKL-ZD-202010）作者简介：汤傲星，男，博士研究生，预防兽医学专业通信作者：刘光清，E-mail：**************.cn.3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析汤傲星1，刘春草1，王真真1,2，孟春春1，朱 杰1，唐井玉1，李传锋1，郭宏元1，宋新宇3，刘光清1（1.中国农业科学院上海兽医研究所 小动物传染病预防与控制创新团队，上海200241；2.新疆农业大学，乌鲁木齐830052；3.动物基因工程疫苗国家重点实验室，青岛266114）2023,31(2):86-92Abstract: To understand the domestic prevalence of Feline p arvovirus (FPV) and its genetic variation and evolution, 30 anal swabs suspicious of FPV infection were collected for virus isolation. As a result, 3 FPV isolates were obtained and their VP2 gene was sequenced by PCR. Then VP2 gene homology of the epidemic strains and vaccine strains reported in the literature were aligned for genetic evolution analysis. The results showed that the VP2 gene of these 3 isolates had nucleotide and amino acid sequence identities at 98.6%-99.8% and 98.5%-99.8% with domestic/international reference strains and at 99.1%-99.4% and 99.1%-99.5% with the domestic vaccine strain. Furthermore, phylogenic tree analysis showed that these 3 isolates were grouped in the same branch as the domestic epidemic and vaccine strains except that the SH612 and ZZ6293 isolates are not in the same branch as the domestic vaccine strain. These results showed that the domestic FPV was obviously experiencing evolutionary trend, which was the reason why traditional vaccines couldn’t achieve good· 87 ·汤傲星等：3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析第31卷第2期 猫细小病毒（ F eline parvovirus, FPV）俗称猫瘟病毒，是一种可感染猫科动物的常见病原体，属于细小病毒科。

通用型和o型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用王淑娟，王东方，刘影，杨海波，赵胜杰，曹伟伟，王翠，赵雪丽，马震原，闫若潜(动物疫病预防控制中心，郑州450008)摘要:为建立通用型和O型口蹄疫病毒(FMDV)二重荧光定量RT-LCR检测方法，本试验根据GenBank已登录的不同亚型FMDV通用序列和O型FMDV序列设计了2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针，经过反应条件和体系优化，建立了通用型(T型)和O型FMDV的二重RTACR(FQ-LCR)检测方法，并进行了、和重复性试验;对15份临床疑似样品进行了应用检测。

结果表明，成功建立通用型和O型FMDV二重FQ-LCR检测方法，该方法可地扩增经灭活的O型、A型与Asia I型口蹄疫病毒标准株细胞培养物混合物，但对BHK-21细胞和PEDV、TGEV、SVV等病原对照不出现特异性扩增曲线，特异性好;检测模板最低极限为101101拷贝/"L,敏感性高，重复性好；自15份临床疑似FM-DV感染样品中检出9份FMDV-T阳性,7份FMDV-O阳性，检测结果与测序结果完全一致，且与国家口蹄疫参考实验室复核结果一致。

本试验成功建立了通用型和O型FMDV二重FQ-LCR检测方法，为FMDV的快速检测及O型FMDV的分型诊断提供了、、的方法。

关键词：口蹄疫病毒；二重荧光定量RT-LCR；建立；应用中图分类号：R373.9文献标志码山文章编号：0529—6005(2020)09—0020—06 Establishment and Application of Universal and Type O FMDV byDuplex Real-time RT-PCRWANG Shu-juan，WANG Dong-fang，LU Ying，YANG Hai-bx，ZHAO Sheng-jie，CAO Wei-wal，WANG Cui，ZHAO Xue-F，MA Zhen-yuan，YAN Ruv-qian(Henan Centre Z ov Animal Disease Control&Prevenhon，Zhengzhou450008，China) Abstract:Tv detect universal and type O FMDV，a duplex real-Fnie euorescencc quantitative RT-LCR method was established by using the TaqMan MGB probe technique.Two sets ol specific primers and probes were designed based on universal sequence from different subtypes and type O FMDV arailabm in GenBank to establish the dupUx euorescc quantity RT-LCR(FQ-LCR)assay based on TaqMan MGB probe technique-The specificity，sensitivity and stabi/ty of FQ-LCR were tested，and15clinic suspicious FMDV in­fected samples were detected by the FQ-LCR assay.The results indicated that the FQ-LCR assay was successfully established，and the specificity ol FQ-LCR assay revealed that amplifications was shown on mixture ol standard cell cultures including O，A and Asia I FMDV，but other pathogens and BHK-21cell control had no amplifications.The sensitivity ol the assay was10copies/"L.Mean­while，9FMDV-T positive and7FMDV-O samples were detected，which were consistent with the sequencing results and the results by national foot-rnd-mouth disease reference laboramm•The duplex FQ-LCR assay ol universal and type O FMDV was specific，sensi­tive，rapid and suitable for early detection ol universal and type O FMDV-Key words:foot-rnd-mouth disease virus；duplex real-Fnie RT-LCR；establishment；applicationCorressonding author：YAN Ruo-qian，E-mail:yrql688@口蹄疫(Foot-rnd-mouth disexsa，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-rnd-mouth disexsa vies，FMDV)引起收稿日期：2018—12—24基金项目：河南省科技创新人才计划项目(174200510003)作者简介:王淑娟(1985-)，女,兽医师，硕士，从事动物疫病预防与控制工作，E-mail:snowangel5f7@163-com通讯作者：闫若潜,E-mail：yml6&&@ 的急性、烈、高度、水疱疾病，以发热，唇、口腔黏膜、乳房及蹄烂斑或水疱性理为典型的临床(1A)。

第25章病毒感染的检查方法与防治原则第一节病毒的诊断随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。

病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。

早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。

此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。

标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。

根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。

由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。

如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。

血清抗体检测标本应保存于－20℃。

病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。

在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。

接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。

当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。

这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。

虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。

如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。

如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。

金黄色葡萄球菌Coa基因的克隆、表达及生物活性检测张洪波;杨宏军;葛利江;何洪彬;杨少华;王长法;高运东;仲跻峰【摘要】[目的]克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性.[方法]用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其血浆凝固效价.[结果]扩增出了2 106 bp的Coa基因,其包含1个完整的开放阅读框,编码含701个氨基酸的成熟多肽;IPTG诱导后该基因表达的融合蛋白分子质量为100 ku,目的蛋白产量占菌体总蛋白的13%;纯化的重组蛋白含量为0.047 mg/mL,其对兔血浆凝固效价为0.012 mg/mL.[结论]成功地克隆、表达了金黄色葡萄球菌Coa 基因,Coa凝固血浆效价为0.012 mg/mL.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(039)003【总页数】5页(P45-48,53)【关键词】金黄色葡萄球菌;血浆凝固酶;克隆;表达;活性分析【作者】张洪波;杨宏军;葛利江;何洪彬;杨少华;王长法;高运东;仲跻峰【作者单位】山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东农业大学,动物医学院,山东,泰安,271018;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东农业大学,动物医学院,山东,泰安,271018;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100;山东省农业科学院,奶牛研究中心,山东,济南,250100【正文语种】中文【中图分类】S858.23奶牛乳腺炎一直是造成奶牛养殖业和乳品工业巨大经济损失的最重要疾病之一[1]。

PCR技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

近年来，PCR技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。

本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术上的支持。

关键词：荧光定量PCR RT-PCR 探针引物（一）PCR技术简介及其运用概述聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。

聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。

聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

1、PCR技术原理双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

2、PCR工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA 聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

盖他病毒研究进展韦鹏建;冯若飞;马忠仁【摘要】盖他病毒是披盖病毒科甲病毒属成员的一种单链线形RNA病毒,广泛分布于亚洲及澳大利亚北部的太平洋沿岸地区,其原型株为MM2021.病毒对去氧胆酸盐和氯仿等一些有机溶剂及酸敏感,主要侵害马和猪,易感的细胞系有Vero、BHK-21、C6/36、MA-104、Hmlu和RK-13等.目前,关于盖他病毒的研究还较少,很多机理尚未清楚,其危害程度亦不可预知.因此,论文就盖他病毒的特性做了一些简要总结概括,为建立和完善人畜共患病公共卫生体系和早期预警机制提供一些知识贮备.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)008【总页数】4页(P97-100)【关键词】盖他病毒;人畜共患病;蚊虫媒介【作者】韦鹏建;冯若飞;马忠仁【作者单位】西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州,730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州,730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州,730030【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种RNA病毒,属披盖病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alpha virus)成员。

广泛分布于亚洲及澳大利亚北部的太平洋沿岸地区,在中国、印度、巴基斯坦、东南亚、日本等国家和地区均有盖他病毒流行的报道[1-2]。

最初是由美国陆军医学研究部门于1955年从马来西亚的雪背库蚊(C.gelidus)中分离获得,命名为Getah virus,其原型株为MM2021[3]。

此后,在日本、前苏联的东部、东南亚和澳大利亚等地,从三带吻库蚊,刺忧伊蚊和猪的血液中也分离到了盖他病毒[4]。

自该病毒被发现以来,人们就一直关注它的传染性和致病性,在欧洲、亚洲、大洋洲一些国家的人、猪、马、牛、山羊、犬、兔、袋鼠、鸡和部分野鸟体内都检测到盖他病毒抗体的存在[5]。

关于加强人兽共患病研究与防控的建议山东省农业专家顾问团畜牧分团沈志强人兽共患病是1979年由世界卫生组织和联合国粮农组织共同命名的。

它是指人和脊椎动物由共同病原体引起，又在流行病学上有关联的疾病。

人兽共患病还称为动物源性疾病，除了源于家畜、家禽和饲养的宠物外，还可源于野生动物、鸟类、水生动物等。

其中由野生动物引起的人兽共患病又称为自然疫源性疾病。

引起人兽共患病的病原体种类很多，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等。

据不完全统计，现已发现的由各种病原体引起的人兽共患病多达140余种。

人兽共患病与人类生活、生产的很多领域都密切相关。

例如，饲养家畜（猪、牛、羊等）可以染患布氏杆菌病，饲养家禽可能染患禽流感，饲养宠物（狗、猫、鸟类等）可能染患狂犬病、弓形虫病、鹦鹉热等。

近年来，由于人们喜欢吃生的肉类食品，加之烧、烤、涮等食用方法，往往食品未熟，且人们的食肉品种也更加丰富，除了猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、鱼、虾、蟹等以外，还有狗、蛇、蛙、蝲蛄、螺以及很多野味，如果这些动物感染了某些疾病，其肉食品又没做熟，病原体未被杀死，人食用后就有可能罹患一些疾病。

卫生部调查发现，以华支睾吸虫感染而引起的肝吸虫病为代表的食源性寄生虫病较为严重，估计华支睾吸虫感染者达1200多万人。

随着人民生活水平的提高，饮食来源和方式的多样化，由食源性寄生虫病造成的食品安全问题将愈加突出。

目前，食源性寄生虫病在城市有增加的趋势。

这种寄生虫病一般可分为六大类：例如植物源性寄生虫病，如姜片吸虫病；肉源性寄生虫病，如旋毛虫病、绦囊虫病、弓形虫病；螺源性寄生虫病，如广州管圆线虫病；淡水甲壳动物源性寄生虫病，如肺吸虫病；鱼源性寄生虫病，如肝吸虫病等，共有30余种。

我国人兽共患病的种类繁多，约130多种。

一些老病种有的长期流行不断，有的又死灰复燃，再度肆虐，新病种又不断增多，对人兽危害极大，对21世纪人兽共患病防制任务的长期性和艰巨性，应保持清醒的头脑，应注意不断流行、再度肆虐的原有疾病；新出现的和还可能有潜在的新疾病出现等多种情况，作好切实有效的研究和防制。