基因枪法获得Phs-r转基因小麦植株的研究

小麦成熟期穗发芽作为一种品质性状和抗逆性状,一直倍受各国育种家的重视。

以往对抗穗发芽育种主要通过两条途径,一是以种皮色泽及一些生理指标为标记进行选择育种。

二是选择早熟品种,避开梅雨季节而防止穗发芽,这样得到的抗性品种,一方面抗性水平有限;另一方面早熟品种则因生育期缩短而影响产量水平。

近年来,许多研究表明α-淀粉酶活性的提高是造成穗发芽的直接原因[1],且控制α-淀粉酶活性的基因已被分离[2,3,4],为小麦抗穗发芽分子育种奠定了基础。

在已分离的抗穗发芽基因基础上,采用气动式基因枪,将抗穗发芽基因与抗除草剂基因导入栽培小麦品种中,通过优化轰击条件,利用优化的再生培养系统,获得再生植株,为解决当前生产中存在的穗发芽问题,提供可利用的种质资源。

1材料和方法1.1材料普通小麦豫麦34、豫麦18-64、温麦6号和济麦1号四个品种为转化起始材料;愈伤组织诱导培养(M S基本培养基+2mg/L 2,4-D+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),分化培养基(M S 基本培养基+1.0mg /LZ T+3-5mg /Lbialaphos+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),生根培养基(1/2M S 基本培养基+0.2mg /LNAA+1-2mg/L Lbialapho s +0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8);质粒pBluescript SK+:含种子发芽启动子Gli 及其下游的抗穗发芽基因(Phr-r )插入质粒的多克隆位点(M CS ),另一质粒,将CaM V35S 启动子及位于下游的bar 基因插入其多克隆位点作为筛选标记。

1.2方法剪取开花后12～14d 的幼穗,剥取幼嫩种子,用70%的酒精表面消毒1min ,无菌水冲洗3次,再用0.1%的升汞(Hgcl 2)消毒10min ,无菌水冲洗3～4次,在超净工作台解剖镊剥出幼胚,盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基上,放在直径9cm 培养皿中央2cm 的范围内,用Parafilm 进行封口,25℃暗培养待用。

在基因枪轰击之前6h 和轰击后18h ,将经预培养的小麦幼胚盾片向上分别转接在含0.1mol/L ,0.5mo l/L ,1.0mol/L ,1.5mol/L 甘露醇的诱导培养基上,进行渗透基因枪法获得Phs-r 转基因小麦植株的研究姜晓东(山西农业大学农学院,山西太谷030801)摘要:实验以普通小麦豫麦18-64品种为供试材料,采用基因枪法对报告基因(Bar 基因)和目的基因(PHS-r 基因)两个重组质粒进行了共转化,获得了再生植株,并对转化植株进行了检测。

结果表明:以预培养15d 的幼胚愈伤组织作为受体材料其转化频率明显高于当天剥取和预培养3～4d 的幼胚;在基因枪轰击前6h 和轰击后18h ,用0.5mo L/L 的甘露醇进行渗透处理,其转化频率会有明显的提高;实验通过基因枪转化与再生培养,共获得了12株再生植株,PPT 检测且均表现出抗性,其中6株经PCR 检测呈阳性,表明PHS-r 基因已整合到小麦基因组中并正常表达。

关键词:小麦;基因枪转化;抗穗发芽基因(PHS-r)中图分类号:S512.1文献标识码:A文章编号:1002-2481(2007)12-0010-02Study on Obtaining Transgenic Wheats with Phs-r Geneby Particle BombardmentJIANG Xiao-do ng(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu S hanxi ,030801,China)Abstr act:I n this paper ,the tested ma ter ials wa s Y uMa i 18-64cultiva r.The two pla smids with PHS -r ge ne and Ba r ge ne wer e co-tr ansform ed by par ticle bomba rdme nt.The r egene rate d plantle ts were obta ine d a nd the tra nsf or me d pla nts we re a nalyzed.The re sults showed that the im ma tur e e mbryos pre -c ulture d for fifte en days ha d a higher tr ansforma tion fre quenc y than tha t of pr e-c ulture d thr ee to four days a nd imm ature em br yos.0.5M ma nnitol tr eatm ent from 6h be fore to 18h after bombar dme nt could incre ase the tr ansform ation fr equency.Twelve re gene ra ted plantle ts wer e obta ined by optim um plant regene ra tion c ulture and PPT sc re ening,which a ll we re positive in Bia la phos re sistance a nd six plants we re positive individuals by the PCR a ssay.Key wor ds:Whe at ;Pa rtic le bombar dme nt ;P HS-r ge ne山西农业科学2007,35(12):10～11Journal of Shanxi Agricultural Science s*收稿日期5作者简介姜晓东(65),男,山西太谷人,讲师,主要从事统计方面的研究工作。

:2007-10-1:19-10备注:4次重复平均数显著水平为1%表1豫麦18-64受体材料对基因转化频率的影响受体材料接种数抗性愈伤组织数再生植株幼胚(0天)20053(26.96%)B 8幼胚(3-4天)20059(29.97%)B12幼胚愈伤组织20080(40.25%)A 28表2豫麦18-64不同浓度甘露醇处理对转化频率的影响甘露醇浓度轰击愈伤组织数分化率再生植株数050 1.6%C 10.150 1.9%C 20.55022.0%A 1055%B 55%D备注次重复平均数显著水平为%图1小麦再生植株T0代目的基因的P CR 检测注:M 分子量标志:1为水样;2为阴性对照;3-9为豫麦18-64;10为阳性对照;500bp474bp处理。

渗透处理结束后,分散开暗培养2周(其温度为25±1℃),使受损伤的组织恢复生长。

恢复培养15d 后,将幼胚、幼胚愈伤组织转到含PPT 为3mg/l的愈伤组织继代培养基中进行筛选培养,以后每2周继代一次;6周后,将每个培养皿中胚性愈伤组织转到M S 分化培养基上,分化培养2周继代一次。

当愈伤组织在分化培养基长出2～3cm 的嫩芽时,将其转到1/2M S 生根培养基上使其生根,植株基部形成发达的根系后,炼苗3～5d ,可移栽入大田。

剪取转基因再生植株(T0)与相应未经转化的对照小麦植株叶片各0.5g ,采用SDS 法提取总D NA 。

以提取的DNA 为模板,用特异性引物进行PCR 扩增,其序列为:(引物1:5`-GAA CCT GTG CT G GAT CCAGAG CT G-3`;引物2:5`-CCAA TCT GT G CCA GCC AT G C -3`)。

2结果与分析2.1不同类型的受体材料对基因转化频率的影响由于不同类型的受体材料生理状态不同,直接影响基因的转化频率,从而影响再生率。

本试验对在M S 培养基上预培养0和3～4d 的幼胚,培养2周的幼胚愈伤组织作为受体材料进行了轰击转化,其转化结果见表1。

在三种受体中,以幼胚愈伤组织作为转化受体获得的抗性愈伤组织频率较高为7.2%,而接种当天的幼胚获得的抗性愈伤组织频率最低,用幼胚愈伤组织作为遗传转化的受体要好于幼胚。

2.2甘露醇处理对幼胚愈伤组织基因转化频率的影响25℃暗培养诱导的幼胚胚性愈伤组织,在轰击前6h 转移到附加不同浓度甘露醇的诱导培养基中,轰击后18h 转移到不加甘露醇的诱导培养基上,以检测不同浓度甘露醇处理对幼胚愈伤组织转化效率的影响,结果由表2可以看出:当甘露醇浓度为0.5mol/l 时抗性愈伤组织分化频率达到22.0%,并且分化出2株幼苗。

因此认为甘露醇浓度为0.5mo l/l 比较适宜。

表型观察表明:甘露醇处理后的受体材料经轰击后,其损伤程度与对照相比大大减轻,结构仍相对紧密,呈淡黄色,生长速度快。

2.3T 0代再生植株的检测选取移栽成活12株小麦和对照CK 的叶片分别提取DNA ,采用引物I 和引物Ⅱ对其进行PCR 特异性扩增,以质粒DNA 作为阳性对照,未转化株为阴性对照,取PCR 产物各2L 进行琼脂糖凝胶电泳(1.0%),以λDNA (Eco r Ⅰ/Hind Ⅲ酶切)为标样。

电泳结果见图1。

其中有6株小麦基因组DNA 能扩增出一条介于500～250bp 之间约474bp 的一条与质粒DNA 相一致的特异带,而对照植株未能扩增出目标带。

表明抗穗发芽基因PHS-r 已被导入小麦再生植株。

3讨论3.1高渗处理对基因枪转化的影响许多研究表明高渗处理可以提高转化率,但处理的时间与浓度不相同。

研究表明:外源DNA 的稳定整合似乎发生在大部分含微弹并存活48h 的细胞中,因此,转化细胞的存活率成为转化成功与否的限制因素,而高渗处理将有利于转化细胞的有效恢复。

而高渗处理将有利于转化细胞的有效恢复。

可能是因细胞在高渗条件下发生了质壁分离,从而减少在微弹穿孔时细胞质的泄漏,提高了细胞的生存能力。

3.2受体材料的生长状态受体材料的生长状态也是影响基因枪转化率的关键因素之一。

在幼胚作为受体材料进行基因转化时许多实验室采用预培养5～7d 的幼胚作为受体材料。

实验表明,用预培10～15d 的幼胚胚性愈伤组织作为受体材料,幼苗的分化率高于幼胚,也高于预培养3～4d 幼胚。

据观察,培养10～15d 后幼胚胚性愈伤组织的耐受力不仅增加,而且生长速度明显加快,细胞逐渐变得致密,减少了基因枪轰击造成的伤害。

参考文献:[1]黄粤,柯遐义,李宝健,等.通过基因枪轰击转化获得转基因小麦植株的研究.西北植物学报,1997,17(2):142-146.[2]毛白韧.小麦种子休眠特性的遗传及其机理的研究.中国农业科学,1983,6:53-59.[3]肖世和国外小麦抗穗发芽研究概况国外农学麦类作物,5,6:36[]张海峰,卢荣禾小麦穗发芽抗性机理与遗传研究作物学报,3,(6)535姜晓东:基因枪法获得Phs-r 转基因小麦植株的研究1.00 4.41.01.00:41..-1981-1.4..199191:2-29.11。