细胞转染实验注意事项

一、实验目的本实验旨在通过转染技术将外源基因导入哺乳动物细胞中，以研究该基因在细胞中的表达情况及其生物学功能。

具体目标包括：1. 成功构建并转染含有目标基因的质粒载体。

2. 检测转染细胞中目标基因的表达水平。

3. 分析目标基因对细胞生物学功能的影响。

二、实验材料1. 细胞：HEK293细胞（人胚胎肾细胞系）2. 质粒载体：pEGFP-C1（绿色荧光蛋白基因）3. 转染试剂：Lipofectamine 20004. 其他试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素-链霉素混合液等5. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪、PCR仪、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 质粒提取：按照试剂盒说明书提取pEGFP-C1质粒。

3. 转染：- 将HEK293细胞用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度至1×10^6细胞/毫升。

- 将Lipofectamine 2000试剂与pEGFP-C1质粒按照说明书比例混合，室温孵育20分钟。

- 将混合液加入细胞培养皿中，轻轻混匀，培养6小时。

- 将培养皿中的混合液弃去，用新鲜DMEM培养基培养细胞。

4. 基因表达检测：- 荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察转染细胞中的绿色荧光蛋白表达情况。

- Western Blot检测：收集转染细胞，提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，转膜，抗体孵育，化学发光检测。

- 流式细胞术检测：收集转染细胞，进行流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达水平。

5. 功能分析：- 将转染细胞进行体外实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，分析目标基因对细胞生物学功能的影响。

四、实验结果1. 荧光显微镜观察：转染细胞中绿色荧光蛋白表达明显，绿色荧光均匀分布。

2. Western Blot检测：转染细胞中绿色荧光蛋白表达量明显高于未转染细胞。

siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。

一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。

可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。

由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。

下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。

若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。

1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。

接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。

注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。

可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。

2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。

（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。

注意孵育时间不能超过25min。

（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。

此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。

表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。

第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。

为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。

本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。

二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。

2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。

3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。

4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。

三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。

2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。

传代过程中，注意无菌操作，避免污染。

3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。

4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。

四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。

2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。

3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。

五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。

2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。

六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。

2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。

3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。

七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。

2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。

八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。

瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。

本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。

一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。

常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。

1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。

转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。

1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。

1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。

二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。

2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。

2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。

2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。

2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。

三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。

3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。

3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。

3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。

3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。

总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。

PEI细胞转染液是一种广泛应用于实验室的转染试剂，用于将外源DNA或RNA 转染到细胞中。

以下为PEI细胞转染液的标准使用方法：一、准备工作1. 细胞：选择合适的细胞类型，如HEK293、CHO等。

确保细胞状态良好，密度适中。

2. 转染试剂：PEI细胞转染液。

3. 外源DNA或RNA：需转染的基因或表达载体。

4. 实验器材：离心机、显微镜、培养皿、移液器等。

二、操作步骤1. 细胞培养：将细胞接种于适当的培养皿中，用含适当抗生素的培养基培养细胞。

将培养皿放入37℃、5% CO₂的培养箱中，进行细胞培养。

2. 转染液制备：根据实验要求，将PEI细胞转染液按照一定比例稀释。

一般情况下，可以使用10倍稀释的PEI细胞转染液。

3. 转染操作：（1）将稀释后的PEI细胞转染液与外源DNA或RNA混合均匀。

（2）用移液器将混合液滴加到细胞培养皿中，注意不要直接将液体倒在细胞上，以免破坏细胞。

（3）将培养皿轻轻摇晃，使转染液与细胞充分接触。

然后将培养皿放入培养箱中，继续培养。

4. 转染后处理：转染后的细胞需要继续培养，观察转染效果。

根据实验要求，可使用荧光显微镜、实时定量PCR等方法检测转染效果。

三、注意事项1. 操作过程中，应确保实验器材干净无菌，避免污染。

2. 转染过程中，应控制转染液的浓度和滴加速度，避免对细胞造成过度刺激。

3. 转染后，注意观察细胞状态，如出现异常情况，应立即处理。

4. 实验过程中，应遵循实验室安全规定，确保人身安全。

以上为PEI细胞转染液的标准使用方法。

实际操作过程中，可能因实验条件、细胞类型等因素而有所调整。

在实际应用中，请根据具体情况进行操作。

质粒转染的注意事项质粒转染是一种常用的基因工程技术，可用于将外源基因导入细胞中，从而研究基因功能、基因表达等。

在进行质粒转染实验时，需要注意以下几个方面。

1. 质粒的选择：选择合适的质粒非常重要。

质粒应具有适当的载体背景，含有适合宿主细胞的选择标记，如抗生素抗性基因。

此外，质粒应具有高复制稳定性、适当的DNA大小，以便在转染过程中高效地将质粒导入细胞内。

2. 细胞系的选择：选择适当的宿主细胞系非常关键。

宿主细胞的增殖率和转染效率应尽可能高，以便获得足够的转染细胞。

一般常用的细胞系有293细胞、CHO细胞、HEK293细胞等。

此外，细胞系的鉴定和维护也很重要，例如对细胞的鉴定和培养条件的优化。

3. 转染方法的选择：质粒转染有多种方法，如钙磷法、聚合物法、电穿孔法、脂质体转染法等。

选择适当的转染方法可以使质粒高效地导入细胞内。

不同的细胞系和质粒可以有不同的转染条件，需要根据实验的具体要求来选择。

4. DNA的纯化：在进行质粒转染之前，需要对DNA进行纯化。

纯化的DNA 应该具有高质量和高浓度，以确保转染效率和表达效果。

DNA纯化可以通过常见的方法，如碱提取法、商业化妆品纯化盒等。

5. 转染条件的优化：转染条件包括细胞密度、转染时间、DNA浓度、转染剂的用量等。

这些条件需要根据实验的具体要求来进行优化。

通过调整这些条件，可以提高转染效率和表达效果。

6. 转染后的处理：转染后，细胞需要恢复一定的时间，以便表达外源基因。

在这个过程中需要注意培养条件的控制，如增加抗生素选择压力以去除未转染的细胞，同时注意细胞的生长状况并进行细胞培养。

7. 转染效率和表达效果的检测：转染效率和表达效果是衡量质粒转染效果的重要指标。

可以通过观察转染细胞的形态、颜色等来初步判断转染效果。

此外，还可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜等方法来进一步检测转染效率和表达效果。

8. 防止污染：在进行质粒转染实验时，需要严格控制环境的无菌性，以防止实验过程中的污染。

CHO-S细胞转染操作规程ExpiCHO™ Expression Medium不会抑制转染，因此转染时无需更换培养基。

一、实验材料：1、ExpiCHO-S™ cells cultured in ExpiCHO™ Expression Medium。

2、无菌、无苯酚、无氯化钠，主要是超螺旋结构的含目的基因的质粒。

N0te：推荐使用《PureLink™ HiPure Plasmid Ki t 》试剂盒抽提质粒。

为了保证无菌，可以使用0.22um的过滤器过滤质粒。

3、抗体表达阳性对照质粒（100 µL of the 1 mg/mL，由试剂盒提供）4、ExpiFectamine™ CHO Reagent（4℃冷藏使用，使用前无需预热）5、OptiPRO™ SFM complexation medium（4℃冷藏使用，使用前无需预热）6、ExpiCHO™ Expression Medium（使用前预热至37℃）Note:转染过程中不能添加抗生素，否则会影响转染效率。

7、Polycarbonate, disposable, sterile Erlenmeyer flasks。

8、37℃，8%CO2，可空气加湿的摇床。

9、测定活细胞密度和百分比的试剂和仪器。

（牛鲍计数板、台盼蓝染液）二、转染注意事项：1、新复苏的细胞在转染之前至少要传2代以上。

2、所有针对细胞的操作要严格无菌、动作轻柔，避免剧烈的震荡或移液，细胞的健康状态对最大程度的提高转染效率至关重要。

3、如果不使用ExpiFectamine™ CHO Reagent转染高密度的ExpiCHO-S™ 细胞，转染效率将会大幅度降低。

4、ExpiFectamine™ CHO Reagent使用之前柔和颠倒4-5次，确保试剂充分混匀。

5、质粒DNA与ExpiFectamine™ CHO Reagent的混合可在室温下进行，使用4℃冷藏试剂。

6、一旦ExpiFectamine™ CHO/DNA复合物形成，应立刻将该复合物加到细胞悬液中，5分钟之内不影响转染效率，但不能超过10分钟。

PEI转染细胞方法的标准操作规程（编号：031）1、目的及适用范围该SOP用来规范利用PEI为转染试剂进行转染的操作。

2、主要仪器细胞培养箱、细胞培养皿、微量移液器3、试剂及配制方法3.1 PEI (2μg/μL)：采用生理盐水配成2μg/μL，60℃烘箱助溶，完全溶解并冷却后，调pH至7.0（不可回调），0.22μm微孔滤器过滤，分装于1.5mL离心管，储存与4℃备用。

3.2生理盐水：0.9g NaCl溶于100mL纯水中，灭菌后微孔滤器过滤分装于1.5mL离心管，储存于4℃备用。

4、操作步骤4.1 细胞铺于细胞培养皿中，培养过夜；4.2 在转染前1-2h，将细胞培养皿中换成预热的培养基；4.3 将要转染的质粒和转染试剂PEI分别用生理盐水稀释，室温处理5min。

质粒和转染试剂的质量比为1:6；一般质粒和PEI稀释后的每管体积为50μL，如转染的质粒量多，则可对应适当增加生理盐水的量；4.4 将处理好的两者混匀，室温放置15-30 min；4.5 将处理好的样品轻轻且均匀滴加到细胞中；4.6 转染后6-8 h换液；4.7 根据实验需要，在转染后的特定时间收集样品，进行分析。

5、注意事项5.1 细胞如何健康而茁壮成长转染前细胞最好经过1～2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。

注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24h，一旦长满了，转染效率便会降低。

大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。

如果随时间发生61。

质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中至关重要的一步，转染的效率直接影响着整体实验的成败，本文阐述了昆虫细胞扩P1转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染的具体操作步骤与实验体系，同时附有一些我们整理的提高质粒转染效率的注意事项，供大家参考。

1、昆虫细胞扩P1转染：（1）取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞铺六孔板，90万/孔；（2） 27°静置培养30 min,待完全贴壁后进行转染；（3）转染体系注：转染过程中一个实验一个滤器一个离心管，完全独立，避免交叉污染；质粒室温预热，转染试剂和培养基37度预热3、ExpiCHO细胞转染：（1）前一天取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞稀释至3-4 x10^6个/ml；（2）转染当天细胞计数7-9 x10^6个/ml细胞状态良好，活力98%以上,将细胞稀释至6 x10^6个/ml；（3）转染体系（3）.细胞种类不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。

如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。

（4）DNA纯度在制备高纯度质粒时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）, A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右①内毒素小于0.128 eu/ug②质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠③质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染（5）.转染试剂转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

细胞sirna转染操作流程引言：细胞sirna转染是一种常用的实验技术，用于研究基因功能和基因调控机制。

本文将详细介绍细胞sirna转染的操作流程，以帮助读者全面了解该技术并正确进行实验。

一、实验前准备在进行细胞sirna转染实验之前，需要进行以下准备工作：1.1 细胞培养选择适当的细胞系并进行培养，确保细胞处于良好的状态。

培养细胞时，需注意细胞密度和培养基组分的合理调配，以保证细胞的健康生长。

1.2 设计sirna序列根据研究目的，设计合适的sirna序列，选择靶向特定基因的sirna。

确保sirna序列的特异性和有效性，以提高实验结果的可靠性。

1.3 转染试剂准备准备细胞转染试剂，如转染试剂A和转染试剂B，根据试剂说明书进行配制。

确保试剂的质量和浓度符合实验要求。

二、细胞sirna转染操作流程细胞sirna转染的操作流程包括以下步骤：2.1 细胞分装将培养好的细胞按照需求分装到培养皿或孔板中，使细胞达到适当的密度。

根据实验设计，将不同处理组的细胞分装到相应的培养皿或孔板中。

2.2 转染试剂配制根据转染试剂说明书的要求，将转染试剂A和转染试剂B按照比例配制好。

确保试剂配制的准确性和稳定性。

2.3 sirna转染将设计好的sirna溶解在适量的转染试剂中，形成sirna转染复合物。

将转染复合物加入到细胞培养皿或孔板中，轻轻摇晃培养皿或孔板，使转染复合物均匀分布。

2.4 培养细胞将转染后的细胞置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。

根据实验要求，培养时间可根据需要延长或缩短。

2.5 细胞采集培养一定时间后，根据实验要求采集转染后的细胞。

采集细胞时，可选择细胞裂解液进行细胞裂解，以获得细胞内的目标蛋白或核酸。

2.6 目标分析采集到的细胞样品可用于进一步的目标分析。

根据实验需要，可以选择Western blot、PCR等技术进行目标蛋白或核酸的检测和定量。

三、实验结果分析根据实验结果，进行数据统计和分析。