中波紫外线对角质形成细胞MMP-9及TIMP-1的影响

天津医药２０１２年７月第４０卷第７期　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．０２５３－９８９６．２０１２．０７．００４　中波紫外线对角质形成细胞ＭＭＰ一９及ＴＩＭＰ一１的影响　王晶晶车雅敏刘原君王璐柯吴坚刘全忠　６５ｌ　

摘要目的：研究中波紫外线（ＵＶＢ）照射对ＨａＣａＴ细胞中基质金属蛋白酶一９（ＭＭＰ一９）和基质金属蛋白酶抑制　剂一ｌ（ＴＩＭＰ—１）ｍＲＮＡ表达的影响。方法：培养ＨａＣａＴ细胞，绘制细胞生长曲线，经不同剂量（０、３０、６０、９０　ＩＩｌＪ，ｃｍ２）ＵＶＢ　照射；用ＭＴｒ方法测定ＵＶＢ照射后细胞的增殖活性，反转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）方法测定ＵＶＢ照射后ＨａＣａＴ细　胞中ＭＭＰ一９　ｍＲＮＡ和ＴＩＭＰ一１　ｍＲＮＡ的表达。结果：随着照光剂量的增大，细胞的增殖活性逐渐降低，而细胞的增殖　抑制率逐渐增加，不同照射剂量各组间光密度（ＯＤ）值差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；随着照光剂量的增大，ＭＭＰ一９　ｍＲＮＡ的表达逐渐增加，各组之间比较差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＴＩＭＰ—ｌｍＲＮＡ的表达逐渐降低，与０　ｒｎＪ／ｃｍ２比　较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ＵＶＢ照射可诱导ＨａＣａＴ细胞损伤和细胞凋亡，ＭＭＰ一９和ＴＩＭＰ一１可能与光老　化的发生有一定关系。　关键词紫外线角蛋白质类光刺激皮肤衰老基质金属蛋白酶９金属蛋白酶１组织抑制剂　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＵＶＢ—Ｉｎｄｕｃｅｄ　ＭＭＰ－９　ａｎｄ　ＴＩＭＰ－１　ｒｎＲＮＡ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＨａＣａＴ　Ｃｅｌｌｓ　ＷＡＮＧ　Ｊｉｎｇｊｉｎｇ，ＣＨＥ　Ｙａｍｉｎ，ＬＩＵ　Ｙｕａｎｊｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｌｕ，ＫＥ　Ｗｕｊｉａｎ，ＬＩＵ　Ｑｕａｎｚｈｏｎｇ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｉａｎｆｉｎＭｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００５２，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｂ（ＵＶＢ）ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ－９）ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ－１）ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＨａＣａＴ）ｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｄｒａｗｎ．Ｍ　ｒｒ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ－　ｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ—ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＭＭＰ－９　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ＴＩＭＰ－１　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　ＵＶＢ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ（０，３Ｏ，６０　ａｎｄ　９０　ｍＪ／ｃｍ２）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＵＶＢ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ＯＤ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ『尸＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＭＭＰ一９　ｍＲＮＡ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＴＩＭＰ－１　ｄｅ・　ｃｒｅａｓｅｄ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　０　ｍＪ／ｃｍ　＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＵＶＢ　ｉｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ．ＭＭＰ－９　ａｎｄ　ＴＩＭＰ一１　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ｐｈｏｔｏａｇ－　ｉｎｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｒａｙｓ　ｋｅｒａｔｉｎｓ　ｐｈｏｔｉｃ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｓｋｉｎ　ａｇｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ一１　紫外线（ｕｖ）辐射是皮肤光老化的重要原因。　日光中的紫外线按其波长的不同可以分为长波紫　外线（ＵＶＡ，３２０～４００　ｎｍ）、中波紫外线（ＵＶＢ，２９０～　３２０　ｎｍ）及短波紫外线（ｕｖｃ，２００～２８０　ｎｍ）。虽然　ＵＶＢ所占紫外线总量不到５％，但研究证实其与皮　肤的光老化密切相关［１－２１。基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）　是降解细胞外基质（ＥＣＭ）的一类重要的蛋白水解　酶，其在正常皮肤组织中表达较低，但有一些ＭＭＰｓ　在受到刺激如炎症、紫外光照射后表达增多，导致　皮肤结缔组织结构重建，引起皮肤老化。基质金属　蛋白酶抑制剂（ＴＩＭＰｓ）是ＭＭＰｓ特异性的内源性抑　制剂，参与调控ＭＭＰｓ在机体组织中的活性变化。　ＭＭＰｓ—ＴＩＭＰｓ之间的平衡在皮肤光老化及其他许多　病理生理过程中占有重要地位。本研究通过体外　培养永生化人角质形成细胞（ＨａＣａＴ细胞），观察特　定ＵＶＢ照射ＨａＣａＴ细胞后基质金属蛋白酶一９　（ＭＭＰ一９）及基质金属蛋白酶抑制剂一１（ＴＩＭＰ一１）　ｍＲＮＡ的表达变化，探讨ＵＶＢ对皮肤细胞的损伤机　制，为临床防治皮肤光老化提供实验依据。　１材料与方法　１．１主要材料与试剂ＨａＣａＴ细胞（中国医科大学何春涤教　授惠赠）、ＤＭＥＭ培养液（ｓｉｇｍａ公司）、小牛血清（天津市灏洋　生物公司）、胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ公司分装，华美生物工程公司）、　Ｔｒｉｚｏｌ（Ｊｔ京天根生化科技有限公司）、ＰＣＲ扩增仪（德国Ｂｅｃｋ．　作者单位：

３０００５２天津医科大学总医院皮肤性病科　６５２　ｍａｍ公司）、凝胶成像仪（英国Ｓｙｎｇｅｎｅ公司）、ＵＶＢ光源（德国　沃德曼）、全波长酶标仪Ｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）。　１．２方法　１．２．１　ＨａＣａＴ细胞的培养ＨａＣａＴ细胞用含１０％胎牛血清　的ＤＭＥＭ培养液于３７℃、５％ＣＯ　饱和湿度下贴壁培养，待细　胞长成致密单层后，以０．２５％胰蛋白酶进行消化传代培养，　以后每隔２　３　ｄ消化１次。将处于对数生长期的细胞接种在　６孔板中。　１．２．２细胞生长曲线的绘制将ＨａＣａＴ细胞消化稀释至２×　１０４／ｍＬ接种于２４孔板，每孔接种１　ｍＬ，于３７℃，５％ＣＯ：培养　箱中培养。每隔２４　ｈ消化收集３孔细胞记数并计算平均值。　细胞每３　ｄ换液１次，连续计数７　ｄ后绘制生长曲线。按生长　曲线取第３天做后续实验。　１．２．３　ＭＴＦ法检测ＵＶＢ照射对ＨａＣａＴ细胞增殖活性的影　响将生长状态良好的细胞制备细胞悬液，以密度为２ｘｌ０４　＋／ｍＬ的ＨａＣａＴ细胞悬液２００　Ｌ接种于９６孔板内，置于　３７　ｏＣ、５％ＣＯ　孵箱继续培养４８　ｈ后，经不同剂量（０、３０、６０、　９０ｍＪＩｃｍ　）ＵＶＢ照射处理，每组６个复孔。于照射２４　ｈ后每　孔加浓度为５　ｇ，Ｌ的ＭＴＴ２０　Ｌ，４ｈ后终止培养，小心吸弃孔　内培养上清液，各孑Ｌ加入１５０　ＩｘＬ　ＤＭＳＯ，置微量振荡器上振　荡１０　ｍｉｎ，全波长酶标仪在波长５７０　ｎｍ处，测定各孔的光密　度（ＯＤ）值，即细胞的增殖活性。按以下公式计算细胞增殖　抑制率＝（０Ｄ　０　ｍＪｌｃｍ２一ＯＤ实验组）／ＯＤ　０　ｍＪ／ｃｍ　×１００％。每　组设６个复孑Ｌ，重复３次。同时设调零孔。　１．２．４反转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）方法检测ＨａＣａＴ细　胞中ＭＭＰ一９、ＴＩＭＰ一１　ｍＲＮＡ的表达（１）接种于６孔培养板　中的细胞待其８０％融合时照射ＵＶＢ。按照射剂量不同分为　０、３０、６０、９０　ｍＪ／ｅｒａ　实验组及阴性对照组。每组设３个平行　孔，于照光后２４　ｈ提取细胞总ＲＮＡ。ＵＶＢ剂量＝ＵＶＢ照射度　［ｍＪ／（ｅｍ　・ｓ）】ｘ时间（ｓ）。（２）Ｔｆｉｚｏｌ提取样本总ＲＮＡ，２％琼脂　糖凝胶电泳鉴定ＲＮＡ；全波长酶标仪测定２６０　ｎｍ和２８０　ｎｍ　波长处ＯＤ值，并计算ＯＤ：　０Ｄ２　比值。ＲＮＡ于一８０℃保存。　（３）ＭＭＰ一９、ＴＩＭＰ一１及　—ａｃｔｉｎ的引物序列参照文献【３—５】设　计，由上海生工有限公司合成并纯化。ＭＭＰ一９引物：上游为　５＇－ＴＣＣ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＴＧＡ　ＧＡＡ　ＣＣ一３　，下游为５　一ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＴＣ　ＴＹＣ　ＣＧＡ　ＧＴＡ　ＧＴＹ一３　，产物大小为３０８　ｂｐ。　ＴＩＭＰ一１引物：上游为５＇－ＡＴＣ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ一３　，下游为５　一ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　Ｔ１Ｔ　ＴＧＡ　ＧＡ一３　，产　物大小为５２０　ｂｐ。Ｂ—ａｃｔｉｎ引物：上游５＇－ＧＴＣ　ＣＴＣ　ＴＣＣ　ＣＡＡ　ＧＴＣ　ＣＡＣ　ＡＣ一３　，下游５　一ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＣ　ＴＹＣ　ＡＴ一３　，产物大小为１８７　ｂｐ。（４）ＲＴ—ＰＣＲ：９４℃预变性３　ｍｉｎ，　９４℃变性４５　Ｓ，５５℃复性４５　Ｓ，７２℃延伸４５　Ｓ，３５个循环；末次　延伸７２℃８　ｍｉｎ。（５）ＰＣＲ产物鉴定：ＰＣＲ产物在２％琼脂糖凝　胶上电泳，用Ｓｙｎｇｅｎｅ凝胶成像仪对ＤＮＡ条带进行光密度扫　描，用ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ图像分析软件进行灰度分析，以条带的ＯＤ　值与条带面积的乘积代表信号强度，用ＭＭＰ－９／１３一ａｃｔｉｎ、　ＴＩＭＰ一１，Ｂ—ａｃｔｉｎ的比值表示ＭＭＰ一９、ＴＩＭＰ一１　ｍＲＮＡ的相对　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｊｕｌ　２０１２，Ｖｏｌ　４０　Ｎｏ　７　含量。　１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ　１７．０统计软件进行数据分析，　多组均数比较采用方差分析，两两比较采用ＳＮＫ－ｑ检验，Ｐ＜　Ｏ．Ｏ５为差异有统计学意义。　２结果　２．１细胞生长曲线细胞数量随时间的增加而增　多，于第７天时长满，生长状态良好，呈典型的铺路　石样。细胞生长曲线见图１。　ｌ２．Ｏ　０　１０．０　Ｚ－８．０　６．０　鼙４－０　导２．０　Ｏ．Ｏ　Ｏ　１　２　３　４　５　６　７　生长天数（ｄ）　Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｆｏｒ　ＨａＣａ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　图１细胞生长曲线　２．２　ＵＶＢ对ＨａＣａＴ细胞增殖活性的影响随着照　光剂量的增大，细胞的增殖活性逐渐降低，而细胞　的增殖抑制率逐渐增加，不同照射剂量各组间ＯＤ　值差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表１。　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　．ａｆｔｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　ＵＶＢ　Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　表１不同剂量ＵＶＢ照射ＨａＣａＴ细胞后细胞　增殖活性的变化