㊀２０２１,３７(２)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２１．００．００４ 实验研究D N A 微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值王㊀悦,孙㊀颖,孙炳奇国家科技重大专项(N o ．２０１８Z X １０１０３００１Ｇ００４Ｇ００２)资助通讯作者:孙炳奇,E m a i l :１８１０２４８７３７６＠１６３．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ８９４７Ｇ９４０３作者单位:沈阳市第十人民医院,沈阳㊀１１００４４摘㊀要:目的㊀评价D N A 微阵列芯片法(以下称芯片法)检测培养阳性患者痰样本的利福平和异烟肼相关耐药基因的效能.方法㊀收集并检测３８９例疑似肺结核患者痰样,以B A C T E C MG I T９６０液体药敏(以下称MG I T９６０药敏)为参考标准,评价芯片法检测样本利福平(R I F )㊁异烟肼(I N H )耐药性和M D R ＧT B 的灵敏度㊁特异度及一致性.应用线性探针耐药技术(G e n o T y p eM T B D R p l u sV E R２,０)对不一致的结果进行分析.结果㊀将３３４例(３３４/３８９)MG I T９６０培阳结果对应的痰处理液进行芯片法耐药检测,其中２例为非结核分枝杆菌,９例为阴性.与参考标准对比,芯片法对利福平耐药检测的灵敏度为９２．４％,特异度为９７．７％,K a p p a 值为０．９０;异烟肼为８２．６％,特异度为９９．２％,K a p p a 值为０．８６.在M D R ＧT B 的病人中,芯片法与MG I T９６０药敏法有较好的一致性;且在初治患者中K a p p a 值为０．９５,灵敏度为９５ ５％,明显优于复治患者.结论㊀线性探针耐药技术对２２份不一致结果进行分析,认为检测限及耐药机制的差异㊁异质性耐药和多重感染等原因是导致基因型和表型或是两种分子法结果不一致的主要原因.应用芯片法检测培阳患者痰样本的利福平和异烟肼的相关耐药基因,与MG I T９６０药敏法相比较具有较好的灵敏度㊁特异度和一致性,可快速检测出患者耐药情况和M D R ＧT B 患者,为临床患者尤其是初治患者提供了快速有效的化疗参考方案.关键词:结核分枝杆菌;D N A 微阵列芯片法;M D R ＧT B ;耐药中图分类号:R ３７８．９１㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０２－０１０９－０６E v a l u a t i o no f t h e p e r f o r m a n c e o fD N A m i c r o a r r a y s i nd e t e c t i n gM T Bd r u g r e s i s t a n c e i n s p u t u ms a m p l e s f r o m p a t i e n t sw i t h c u l t u r e Ｇpo s i t i v e p u l m o n a r yt u b e r c u l o s i s WA N G Y u e ,S U N Y i n g ,S U NB i n g Ｇqi (S h e n y a n g １０t hP e o p l e sH o s p i t a l ,S h e n y a n g １１００４４,C h i n a )A b s t r a c t :T o e v a l u a t e t h e e f f i c i e n c y o f aD N A m i c r o a r r a y c h i p a s s a y i nd e t e c t i n g r i f a m p i c i na n d i s o n i a z i dd r u g re s i s t a n c e g e n e s i n s p u t u ms a m p l e sf r o m p a t i e n t sw i t h t u b e r c u l o s i s c u l t u r e s ,w e c o l l e c t e d a n d d e t e c t e d s p u t u ms a m p l e s f r o m３８９p a t i e n t s w i t hs u s p e c t e d p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s ．T h e s e n s i t i v i t y ,s p e c i f i c i t y a n d c o n s i s t e n c y o f t h e c h i p m e t h o d i nd e t e c t i ng d r u g re s i s t Ｇa n c e t oR I Fa n d I N H ,a n dM D R ＧT Bw e r e e v a l u a t e d ,w i t h t h eMG I T９６０t e s t a s t h e r ef e r e n c e s t a n d a r d ．I f t h e r e s u l t sw e r e i n Ｇc o n s i s t e n tw i t h t h o s e o f t h e r e f e r e n c e s t a n d a r d ,t h eG e n o T y p eM T B D R p l u s t e c h n i q u e f r o mt h eWHO w a s u s e d f o r v e r i f i c a t i o n ．D r ug r e s i s t a n c ew a s d e t e c t e dw i th t h e c hi p m e t h o d i n３３４s p u t u ms a m p l e sw i t h p o s i t i v e r e s u l t sd e t e c t e db y l i q u i dc u l t u r e ,i n Ｇc l u d i n g t w oN TM p o s i t i v e c a s e sa n dn i n en e g a t i v ec a s e s ．C o m p a r e dw i t ht h o s eo f t h e r e f e r e n c es t a n d a r d ,t h ec h i p m e t h o d s s e n s i t i v i t y ,s p e c i f i c i t y a n d K a p pa v a l u ew e r e９２．４％,９７．７％a n d０．９０,r e s p e c t i v e l y ,i nt h er i f a m p i c i nr e s i s t a n c et e s t ,a n d ８２ ６％,９９．２％a n d０．８６,r e s p e c t i v e l y ,i n t h e i s o n i a z i d r e s i s t a n c e t e s t ．I n p a t i e n t sw i t h M D R ＧT B ,t h e r e s u l t sw e r e c o n s i s t e n t w i t h t h o s e o f t h e l i q u i dd r u g s e n s i t i v i t y t e s t ．I n t h e n e wc a s e s ,t h e K a p pa v a l u ew a s ０．９５,a n d t h e s e n s i t i v i t y w a s ９５．５％,v a l Ｇu e s s i g n i f i c a n t l yb e t t e r t h a n t h o s e o f t h e p r e v i o u s l y t r e a t e dc a s e s ．I n ad d i t i o n ,２２i n c o n s i s te n t r e s u l t sw e r e a n a l y z e dw i t hG e n o ＧT y p eM T B D R p l u s v e r ２．０,i t i s c o n s i d e r e d t h a t t h e d e t e c t i o n l i m i t a n dd r u g r e s i s t a n c em e c h a n i s m ,h e t e r o g e n e o u s d r u g re s i s t Ｇa n c e a n d m u l t i pl e i n f e c t i o n a r e t h e m a i n r e a s o n s f o r t h e i n c o n s i s t e n t r e s u l t so f g e n o t y p ea n d p h e n o t y p eo rt w o m o l e c u l a r m e t h o d s ．T h e c h i p m e t h o d f o r t h e d e t e c t i o no f r i f a m pi c i n a n d i s o Ｇn i a z i d r e s i s t a n c e g e n e s i n s p u t u ms a m p l e s o f p a t i e n t sw i t h p o s i t i v e c u l t u r e sh a s g o o d s e n s i t i v i t y ,s p e c i f i c i t y a n dc o n s i s t e n c y,a n dc a n ９０１q u i c k l y d e t e c t r e s i s t a n c e a n d M D RＧT B．T h i sm e t h o d p r o v i d e s a r a p i da n de f f e c t i v e c h e m o t h e r a p y r e f e r e n c e s c h e m e f o r c l i n i c a l p a t i e n t s,p a r t i c u l a r l y n e wc a s e s．K e y w o r d s:M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s;D N A m i c r o a r r a y c h i p m e t h o d;M D RＧT B;d r u g r e s i s t a n c eS u p p o r t e db y t h eN a t i o n a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y M a j o rP r o j e c t(N o．２０１８Z X１０１０３００１Ｇ００４Ｇ００２)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:S u nB i n gＧq i,E m a i l:１８１０２４８７３７６＠１６３．c o m㊀㊀结核病(T B)位居全球单一致死性传染病的首位(排在H I V/A I D S之前),每年约有５０万利福平耐药病例,其中７８％为耐多药结核病(M D RＧT B).我国是全球耐药结核病负担最大的３个国家之一.异烟肼(I N H)和利福平(R I F)的广泛使用及菌体基因突变加剧了耐药性的发生[１Ｇ３].实际工作中,由于传统的药敏试验方法费时㊁繁琐,无法满足快速临床诊断的要求[４Ｇ５].目前,许多快捷高效的分子技术已成功应用于MT B检测,包括实时聚合酶链式反应(R TＧP C R)㊁线性探针耐药检测分析(L P A s)和寡核苷酸或D N A微阵列等.D N A微阵列技术(基因芯片耐药基因检测技术)是指在r p o B㊁i n h A和k a t G基因的特定位置结合特异性核苷酸,检测痰标本中MT B对于利福平和异烟肼的耐药情况.本研究以MG I T９６０药敏试验为参考标准,验证芯片法对M D RＧT B的检测能力.对于芯片法与液体药敏检测不一致的结果,采用WHO推荐的线性探针耐药检测法进行复核,以期客观的探讨芯片法对培阳结核病患者的耐药性的检测能力.１㊀材料与方法１．１㊀材㊀料１．１．１㊀研究对象㊀收集沈阳市第十人民医院２０１９年７至１２月间,３８９名疑似肺结核患者的合格痰样,排除标准为治疗超过两周的患者.年龄分布为２~９０岁,男性入组２８０人(７２．０％),女性入组１０９人(２８．０％).本课题已通过沈阳市第十人民医院伦理委员会批准.１．１．２㊀主要仪器及试剂㊀晶芯ʻR微阵列芯片扫描仪L u x S c a n T M１０KＧB,E x t r a c t o r３６核酸快速提取仪, H y b S e t基因微阵列芯片杂交盒,结核分枝杆菌耐药检测试剂盒,北京博奥晶典生物集团有限公司; MG I T９６０全自动结核分枝杆菌快速培养法仪及配套试剂,美国B D公司;全自动核酸印记微生物检测系统(G TＧB l o t４８)及配套试剂,法国生物梅里埃.１．２㊀主要方法及工作流程㊀见图１.１．２．１㊀痰标本前处理㊀流程按照«结核病诊断实验室检验规程»[６]规定进行,培养法后剩余痰处理液留作芯片法检测及备用.１．２．２㊀培养法㊀按照B A C T E C MG I T９６０系统操作说明书进行操作.仪器报阳后对培养物进行抗酸染色镜检确认,镜下抗酸杆菌扭曲缠绕呈红色绳索状,而其他细菌和细胞呈蓝色.确认为抗酸杆菌后进行M P B６４抗原检测,阳性者进入培养法药敏试验(培养管中的药物终浓度为利福平１．０μg/m L,异烟肼０．１μg/m L).１．２．３㊀芯片法㊀对于培养阳性标本,取出留存的痰处理液,进行芯片法耐药检测.检测耐药位点包括利福平耐药相关基因r p o B基因检测６个位点,即５３１位T C GңT T G㊁５３１位T C GңT G G㊁５２６位C A CңG A C㊁５２６位C A CңT A C㊁５２６位C A CңC T C㊁５２６位C A CңC G C㊁５１１位C T GңC C G㊁５１３位C A AңC C A㊁５１３位C A AңA A A㊁５１６位G A C ңG T C㊁５１６位G A CңT A C㊁５１６位G A CңG G C及５３３位C T GңC C G等１３种突变型,对于异烟肼耐药相关基因k a t G基因及i n h A基因启动子各检测１个位点,分别为k a t G基因３１５位A G CңA C C和A G CңA A C２个突变型,i n h A基因启动子Ｇ１５位C ңT突变型.按照北京博奥生物集团有限公司的试剂盒说明书进行D N A提取,P C R扩增,芯片杂交及结果判读过程,对于 无法判定 的结果及时进行复检,以确定是否有可用的耐药结果.１．２．４㊀线性探针耐药检测法㊀原理基于P C R扩增产物通过反向杂交技术与预先固化在试纸条上的特异性探针杂交,通过条带显色情况判定耐药性.检测耐药基因为r p o B是利福平耐药㊁k a t G是异烟肼高水平耐药和i n h A是异烟肼低水平耐药,在杂交带上３个基因的野生型和突变型均可以体现.标本处理按照法国生物梅里埃有限公司的试剂盒说明书进行,包括D N A提取㊁扩增㊁杂交㊁制备流程.判读标准为野生条带(利福平８个野生探针,异烟肼k a t G和i n h A野生探针分别为１个和２个)均显色且突变条带无显色时为敏感,野生条带有缺失或突变条带显色为耐药.０１１中国人兽共患病学报２０２１,３７(２)图１㊀主要方法及工作流程图F i g．１㊀M a i nm e t h o d s a n dw o r k f l o w１．２．５㊀统计学处理㊀所有检测结果㊁患者基本信息采用S P S S１９．０统计软件进行统计分析.以MG I T ９６０药敏试验结果为参考标准,计算芯片法耐药检测的灵敏度㊁特异度㊁一致性㊁阳性预测值(P P V)㊁阴性预测值(N P V)和K a p p a值以及２种方法对于检测M D RＧT B结果的比对,并对结果不一致者进行统计说明.相关公式解释:灵敏度＝真阳性例数/(真阳性例数＋假阴性例数)ˑ１００％;特异度＝真阴性例数/ (真阴性例数＋假阳性例数)ˑ１００％;阳性预测值＝真阳性例数/(真阳性例数＋假阳性例数)ˑ１００％;阴性预测值＝真阴性例数/(真阴性例数＋假阴性例数)ˑ１００％;一致性＝(真阳性例数＋真阴性例数)/ (真阳性例数＋假阳性例数＋真阴性例数＋假阴性例数)ˑ１００％;K a p p a值ȡ０．７５两者一致性较好;０．４ɤK a p p a＜０．７５两者一致性一般;K a p p a＜０．４两者一致性较差.２㊀结㊀果２．１㊀培养法结果㊀对３８９例疑似肺结核患者的痰样本进行培养,３３４例为培养阳性,其中４０~６０岁年龄段的患者的阳性率最高９０．２％(１５７例);男性患者阳性检出率８８．６％(２４８例)高于女性７８ ９％(８６例);初治患者阳性检出率８６．９％(２３２例)高于复治患者为８３．６％(１０２例),见表１.２．２㊀药敏结果㊀３３４例培阳标本中,２例为M P B６４抗原检测阴性,所以有３３２例进行了MG I T９６０药表１㊀３８９例患者特征和培养法对抗酸杆菌阳性的检出情况T a b．１㊀C h a r a c t e r i s t i c s a n d p o s i t i v e d e t e c t i o n r a t e so fA F B i n３８９p a t i e n t s特征MT B培养阳性(n＝３３４)n(％)总计(n＝３８９)n(％)年龄分组㊀０~２０１０(７６．９)１３(３．３４)㊀２１~４０７０(８３．３)８４(２１．６)㊀４１~６０１５７(９０．２)１７４(４４．７)㊀ȡ６１９７(８２．２)１１８(３０．３)性别㊀男２４８(８８．６)２８０(７２．０)㊀女８６(７８．９)１０９(２８．０)治疗史㊀初治２３２(８６．９)２６７(６８．６)㊀复治１０２(８３．６)１２２(３１．４)敏试验;同时挑出培阳患者的痰处理液,用芯片法检出共３２３例有药敏结果,此外检出非结核分枝杆菌２例,这与M P B６４的阴性检测结果相符,另有９例无结果(未检出MT B),这可能是分子法检出限的劣势所致.与参考标准对比,芯片法检测R I F和I N H 的K a p p a值均大于０．７５,显示了较好的一致性;芯片法除了异烟肼的灵敏度稍低(８２ ６％)外,其他方面的参数均较好,见表２.这个结论和大多数文献报道的基本一致.１１１２期王㊀悦,等:D N A微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值表２㊀芯片法检测利福平和异烟肼耐药与培养法药敏结果的比较T a b．２㊀C o m p a r i s i o no f c h i p a s s a y d e t e c t i o n r e s u l t s f o rR I Fa n d I N Hd r u g r e s i s t a n c ew i t h c u l t u r e a s s a y s芯片常规药敏试验耐药敏感合计灵敏度/％特异度/％一致性/％P P V/％N P V/％K a p p a利福平㊀耐药６１６６７㊀敏感５２５１２５６９２．４９７．７９６．６９１．０９８．１０．９０㊀合计６６２５７３２３异烟肼㊀耐药７１２７３㊀敏感１５２３５２５０８２．６９９．２９４．７９７．２９４．００．８６㊀合计８６２３７３２３２．３㊀芯片法检测M D RＧT B的能力评价㊀根据治疗史的不同,我们将患者分为初治和复治.与参考标准对比,芯片法检测M D RＧT B的灵敏度㊁特异度㊁一致性和K a p p a值见表３.在M D RＧT B的病人中,应用芯片法检测的K a p p a值可以达到０．８６,与液体法药敏试验有较好的一致性;并且在初治患者中K a p p a值为０．９５,灵敏度为９５．５％,明显优于复治患者,这对于更早的指导临床参考用药有着非常重要的意义.表３㊀芯片法对不同治疗史样本患者M D RＧT B结果的判定T a b．３㊀C h i p a s s a y d e t e r m i n a t i o no fM D RＧT B i n p a t i e n t sw i t hd i f f e r e n t t r e a t m e n t h i s t o r i e s芯片常规药敏试验M D R n o nＧM D R合计灵敏度/％特异度/％一致性/％P P V/％N P V/％K a p p a初治㊀M D R２１１２２㊀N o nＧM D R１２０２２０３９５．５９９．５９９．１９５．５９９．５０．９５㊀合计２２２０３２２５复治㊀M D R２６３２９㊀N o nＧM D R７６２６９７８．８９５．４８９．８８９．７８９．９０．７６㊀合计３３６５９８所有病例㊀M D RＧT B４７４５１㊀N o nＧM D R８２６４２７２８５．５９８．５９６．３９２．２９７．１０．８６㊀合计５５２６８３２３２．４㊀不一致的耐药结果㊀本研究中 不一致 的含义为芯片法对利福平和异烟肼相关耐药基因检测结果与MG I T９６０药敏结果不符.总体上看,利福平耐药结果不符者有１１例(表４),其中线性探针法有７例与MG I T９６０药敏法一致,４例与芯片法一致;在异烟肼耐药结果的１７例(表５)不一致中,线性探针法有９例与参考标准一致,有８例与芯片法一致.２１１中国人兽共患病学报２０２１,３７(２)表４㊀３种检测方法对利福平耐药不一致结果的对比分析T a b ．４㊀C o m p a r i s o no f d i s c o r d a n t r e s u l t s f o r d r u gr e s i s t a n c e t oR I Fb y ３me t h o d s 芯片法MG I T９６０药敏试验线性探针法利福平耐药利福平敏感利福平耐药利福平敏感利福平耐药利福平敏感分类S R R A S R R A S R R A SR R A SRRA R S SB R S S B R S R B R S R B R S R B RS RB ㊀㊀注:评价A 为芯片法敏感,MG I T９６０药敏试验法耐药;评价B 为芯片法耐药,MG I T９６０药敏试验敏感.表５㊀３种检测方法对异烟肼耐药不一致结果的对比分析T a b ．５㊀C o m p a r i s o no f d i s c o r d a n t r e s u l t s f o r d r u gr e s i s t a n c e t o I N Ht h r o u gh３m e t h o d s 芯片法MG I T９６０药敏试验线性探针法异烟肼耐药异烟肼敏感异烟肼耐药异烟肼敏感异烟肼耐药异烟肼敏感分类S R R A S R R A S R R A S R R A S R R A S R R A S R RA S R S A S R S A S R S A S R S A S R S A SR S A SRS A R S S B R S S B RSRB ㊀㊀注:评价A 为芯片法敏感,MG I T９６０药敏试验法耐药;评价B 为芯片法耐药,MG I T９６０药敏试验敏感.３㊀讨㊀论本研究显示,芯片法比培养法药敏试验更快速并且具有较好的准确性[７],与参考标准比较,对MT B 耐药检测及M D R ＧT B 检测的灵敏度㊁特异度㊁符合率㊁P P V ㊁N P V 和K a p pa 值与相关报道的结果相似,即芯片法灵敏度中等,但是特异度较高[８Ｇ１０].分类A 中,有５例利福平和１４例异烟肼耐药结果为芯片法敏感而MG I T９６０药敏法耐药.其原因可能是分子法的检测限一般在２０％左右,而表型法的检测限可达到１％[１１];分子法检测的耐药突变位点有限,不能覆盖所有耐药突变的位点;除了位点突变还存在其他耐药机制,如外排泵[１２Ｇ１３],这也是分子检测不能及的.上述情况也可能是导致芯片法在检测９例培阳痰液时出现未检出MT B 的原因.在A 分类中,线性探针共有１２例与MG I T９６０药敏法一致,可能是由于耐药检测范围大于芯片法所致,如芯片法仅检测了r po B 基因核心突变区的６个位点的１３种突变类型,而线性探针技术则通过８条分子探针覆盖了r po B 基因核心突变区的全部２７个氨基酸的８１个碱基[１４];线性探针含有k a t G ３１５(A G CңA C A )㊁i n h A Ｇ１６(TңG )㊁i n h A Ｇ８(TңC )和i n h A Ｇ８(TңA )突变类型,而芯片只在k a t G 和i n h A 基因启动子各测一个位点[１５Ｇ１６].但是我们是对不一致的样本进行线性探针的检测,所以不能以与参考标准一致结果数量多而断定线性探针法的检测结果更接近于参考标准;其次芯片法的自动判读更大程度的避免的人工判读的误差的产生;此外芯片法的封闭式杂交流程更大程度的避免了非特异片段的干扰和交叉污染的产生,降低了假阳性的出现.分类B 中,有６例利福平和３例异烟肼耐药结果为芯片法耐药而MG I T９６０药敏法敏感,这可能的原因是与体外培养可能导致耐药菌亚群比例下降,低于其检测灵敏度有关[１７].也有可能与MG I T ３６０药敏法的利福平终浓度设置过高有关.总之,实验室污染㊁多重感染㊁菌株的低水平耐药㊁耐药和敏感菌落亚群比例不同或异质性耐药存在都可能导致基因型和表型或是两种分子法结果的不一致,异质性耐药被认为是造成表型与基因型耐药结果不符的重要原因[１８].目前,二代测序技术㊁分子克隆与数字P C R 技术在临床和科研方面也广泛应用,本研究中的结果不一致者(包括疑似异质性耐药)可以通过上述技术在未来的研究中进行进一步的验证.３１１２期王㊀悦,等:D N A 微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值４㊀结㊀论中国是耐药高负担国家,有效控制和降低M D RＧT B总体负担迫在眉睫,而WHO推荐的耐药诊断产品多为进口,存在价格昂贵和战略安全的风险.近年来在我国传染病重大专项的支持下,国内的耐药结核病诊断技术研发取得了显著进展,本研究对国产耐药检测产品的临床应用提供了相关资料的支持.虽然无法取代表型药敏技术,但是芯片法其快速㊁准确的特点,仍适用于结核病耐药初筛, M D R结核病患者可以通过适当的二线药物快速治疗,取得更好的疗效,考虑到成本㊁技术专利等问题,国产芯片产品更便于基层临床医院的推广.利益冲突:无引用本文格式:王悦,孙颖,孙炳奇．D N A微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(２):１０９Ｇ１１４．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２１．００．００４参考文献:[１]U n i s s aA N,S u b b i a nS,H a n n aL E,e t a l．O v e r v i e 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