维生素D_3联合高脂饲料建立大鼠动脉粥样硬化模型重点
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ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化模型的建立摘要:ApoE-/-基因敲除小鼠(ApoE-/-)经含有21%脂肪和0.15%胆固醇的高脂饲料喂食12周后进行各项血脂胆固醇水平检测,以及整体主动脉油红0染色与主动脉根部病理切片油红0染色等动脉粥样硬化病理分析。
结果显示经过高脂诱导的ApoE-/-小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯水平均比未经饮食诱导的ApoE-/-小鼠、经同样饮食处理的野生型小鼠以及未经处理的野生型小鼠均显著升高(P<0.05);低密度脂蛋白-胆固醇水平与野生型(正常饮食组和高脂组)相比升高了近3倍多;高脂诱导ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积占整体主动脉面积的65%,显著高于ApoE-/-小鼠的正常饮食组(21%)(P<0.05),同时主动脉根部的血管壁明显增厚,管腔变窄。
实验结果表明通过高脂饲料饮食诱导,成功建立了动脉粥样硬化模型小鼠,可为下游的药物筛选、基因治疗以及动脉粥样硬化机理的体内研究提供理想的实验材料。
关键词:ApoE-/- 小鼠;动脉粥样硬化;胆固醇;血脂;主动脉中图分类号:R394 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2015)02-0141-04The Establishment of Atherosclerosis Model in ApoE-/- MiceOU Hai-long,ZHANG Li-lin,HE Xiao-lan,LI Hong-mei,LEI Ting-wen (Department of Biochemistry and Molecular Biology,Guiyang Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China)Abstract :The ApoE gene knockout mice (ApoE-/-)were fed with a high-fat (HF)diet containing 21% fat and 0.15% cholesterol for 12 weeks to establish atherosclerosis model. After diet induction,the ApoE-/- mice were sacrificed and plasma total cholesterol (TC),triglyceride (TG),low -density lipoprotein -cholesterol (LDI-C)and high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)levels were measured. The whole aortas and sequential sections of the aortic root were stained with oil red 0. Results showed that the plasma levels of TC and TG from HF diet induced ApoE-/- mice were both dramatically higher than normal diet(ND)-fed ApoE-/- mice as well as wild-type mice fed with normal diet or HF diet (P <0.05). The contents of LDL-cholesterol in plasma were elevated by three-fold compared with wild-type (ND and HFD). Atherosclerotic lesion sizes were significantly increased in whole aorta (65%)as compared with normal diet ApoE-/-mice (21%). Similar result was obtained from cross -sections of the aortic root analysis. The results demonstrated that HF diet treatment greatly enhanced atherosclerosis development in ApoE-/-mice. The establishment of atherosclerosis model mice provides a valuable tool for drug screen,gene therapy and even in vivo mechanism analysis in atherosclerosis disease.Key words :ApoE-/-mice;atherosclerosis;cholesterol;lipoprotein;aorta(Life Science Research,2015,19(2):141 ?144)体内的脂类物质代谢异常时,多余的脂质沉积在血管壁上,并逐渐形成斑块,使血管内皮增厚、变硬,是引起动脉粥样硬化(atherosclerosis AS)的重要原因之一。
维生素D3联合尼古丁诱导的血管钙化亚慢性模型的建立王茜倩;闫惠;安春娜;蒲小平【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2009(25)1【摘要】目的建立维生素D,(vitamin D,)联合尼古丁(nico-fine)诱导的大鼠血管钙化亚慢性动物模型.方法采用维生素D3(300 kIU·kg-1)肌注和尼古丁(25 mg·kg-1,5 ml·kg-1)灌胃制备大鼠血管钙化亚慢性模型,定期测定大鼠体重和尾动脉血压;在造模的第8周、第16周,分别测定大鼠心脏系数、血浆钙、磷含量、血管钙含量、血管碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和血管钙沉积等与血管钙化相关的指标,对胸主动脉进行Von Kossa染色.结果第3~8周,VDN(vitamin D3and nicotine)大鼠尾动脉压持续增加,与对照组相比差异均有显著性(P均<0.05).第9周后,仍然维持在较高水平.与对照组相比,VDN组大鼠第8周心脏系数升高8.4%(P<0.01);血钙、血磷分别升高3.2%(P<0.01)和12.0%(P<0.05);血管组织钙含量升高27.0%(P<0.01);血管ALP活性与血管钙沉积分别高151.8%和68.8%(P均<0.01).与对照组相比,第16周VDN组大鼠心脏系数升高7.7%(P<0.01),血钙升高3.2%(P<0.05),血磷降低1.4%;血管组织钙含量升高51.0%(P<0.01);血管ALP活性与血管钙沉积分别高87.2%(P.001),31.6%(P<0.05).Von Kossa 染色结果显示第8周和第16周VDN 组大鼠胸主动脉中膜均有大量深色颗粒沉积.结论维生素D3和尼古丁诱导的16wk大鼠血管钙化亚慢性模型可作为药物筛选和机制研究的疾病模型.【总页数】4页(P129-132)【作者】王茜倩;闫惠;安春娜;蒲小平【作者单位】北京大学药学院分子与细胞药理学系;北京大学药学院分子与细胞药理学系;北京大学药学院分子与细胞药理学系;北京大学药学院分子与细胞药理学系;天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】R-332;R322.121【相关文献】1.白藜芦醇对维生素D3和尼古丁诱导的大鼠血管钙化的抑制作用 [J], 刘国栋;白静;李瑞生;刘秀华;王禹2.应用高脂饮食联合维生素D3建立慢性系膜增殖性肾炎血管病变大鼠模型 [J], 张承英;张建荣;耿燕秋;丁韬3.Ghrelin在维生素D3和尼古丁诱导大鼠血管钙化中的作用 [J], 马涛; 王倩; 程治源; 叶挺; 张宸铭; 盛瑛; 宗刚军4.姜黄素对维生素D3和尼古丁诱导血管钙化大鼠血管中组织蛋白酶D表达的影响[J], 付尧;吴冬冬;李晓东5.睾酮对维生素D3和尼古丁诱导的主动脉血管钙化的影响 [J], 王倩;马涛;程治源;叶挺;凌秋洋;吴婷;宗刚军因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
动物实验期末重点整理实验动物学期末重点题型:选择、判断、填空、名词解释第⼀章绪论1.实验动物的基本概念是什么?指的是⼈⼯饲养,对其携带的微⽣物实⾏控制,遗传背景明确或者来源清楚的,⽤于科学研究、教学、⽣产、检定及其它科学实验的动物。
2.实验动物的四个标准化包括哪些?它包括实验动物的:(1)遗传学控制标准、(2)微⽣物学和寄⽣⾍学控制标准、(3)设施环境控制标准、(4)饲料营养质量控制标准。
3.⽣命科学研究所必需的四个基本条件是什么?AEIRAnimal 实验动物Equipment 仪器设备Information 信息Reagent 试剂4.什么是动物福利?动物福利是指动物在整个⽣命过程中应得到⼈类的保护,其基本原则是要善待动物,保证动物的健康和快乐。
5.国际上对动物实验伦理有哪些要求?1.动物居住空间应符合标准,注意⽇常饲养管理,不使动物陷⼊饥饿、缺⽔和患病。
2.尽可能的采⽤替代法最少地使⽤和牺牲动物。
3.在必须使⽤⽝、猫和猴时,在实验前应进⾏训练,尽可能地减少动物的恐惧和不安。
4.实验结束和动物不可能恢复时,应采取安乐死。
5.要爱护动物和对由于试验死亡的动物应持有怜悯和感激之情。
6.什么是动物实验的“3R原则”?Replacement 替代:尽可能⽤低等实验动物替代⾼等实验动物,⽤离体培养的细胞、组织、器官代替动物个体,⽤微⽣物代替动物,并能获得相同试验效果的科学⽅法。
Reduction 减少:把使⽤动物的数量降低到实现科研⽬的最⼩量Refinement 优化:改善动物设施、饲养管理和实验条件,精选实验动物、技术路线和实验⼿段,优化实验设计和实验操作技术,熟练掌握动物实验技术,减少对动物的损伤,减轻动物的痛苦和应激反应。
第⼆章实验动物的遗传学控制1. 请说出实验动物种、品种、品系的概念。
(1)种(Species):是⽣物分类学上的基本单位,由⾃然选择形成。
(2)品种(stock):是种以下的⾮⾃然分类单位,是⼈们根据不同需要⽽对动物进⾏改良、选择、定向培育,具有某种特定外形和⽣物学特性的动物群体,其特性能较稳定遗传。
绞股蓝总甙片联合辛伐他汀治疗高脂血症作用研究发表时间:2015-12-10T10:49:06.387Z 来源:《中医学报》2015年8月作者:张永昕1 李莎恩1 俞发1 彭红波2[导读] 解放军458医院药剂科广东广州番禺区何贤纪念医院检验科随着经济发展,我国国民饮食结构由以粮食和蔬菜为主转变成高脂肪、高蛋白、高热量的三高饮食。
张永昕1 李莎恩1 俞发1 彭红波21.解放军458医院药剂科广东广州 510602;2.广东广州番禺区何贤纪念医院检验科广东广州 510602【摘要】目的:探讨绞股蓝总甙片与辛伐他汀联合治疗高脂血症的作用。
方法:SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、绞股蓝总甙组(18mg/kg)、辛伐他汀组(4mg/kg)、联合治疗组(绞股蓝总甙18mg/kg、辛伐他汀4mg/kg),每组10只。
采用维生素D3腹腔注射加高脂饲料饲喂法建立高脂血症大鼠模型,各组造模同时给药,观察大鼠一般情况及体重变化,给药10周后麻醉取血,ELISA法测定大鼠血脂、脂联素(ADP)、瘦素(LEP)的含量。
结果:与模型组比较,绞股蓝总甙片与辛伐他汀联合治疗可显著降低大鼠血清TC、TG、LDL-C水平(P<0.01),显著升高HDL-C水平(P<0.01);同时联合治疗可显著升高大鼠血清脂联素(P<0.01)和显著降低瘦素水平(P<0.01),且其对血清脂联素水平的升高作用优于绞股蓝总甙片或辛伐他汀单用组。
结论:绞股蓝总甙片联合辛伐他汀对高脂血症具有明显的治疗作用。
【关键词】绞股蓝总甙片;辛伐他汀;高脂血症;联合治疗【中图分类号】R453 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999(2015)8-0408-02Effect of Gynostemma pentaphyllum of total glucoside Tablets Combined with simvastatin on hyperlipidemia in treating hyperlipemia 【Abstract】Objective:To observe the effect of Gynostemma pentaphyllum of total glucoside combined with western medicine on hyperlipidemia in treating hyperlipemia. Method:SD male rats were randomly divided into normal group、the control group、Gynostemma pentaphyllum of total glucoside Tablets group(18mg/kg)、simvastatin group(4mg/kg)、the combination group,ten rats for each group. The high-lipid diet rat models were made by intraperitoneal injection of all Vitamin D3 at once on high-lipid diet rats. At the same time , each mouse was administrated drug respectively. Observeing their growing situation and weight changes during the time. Ten weeks later, the rats were drawed blood after anesthesia, then rats serum bloodlipid (TC、TG、LDL-C、HDL-C) and serum adiponnectin, leptin were measurated adopting the ELISA method. Results:Compared with the control group, the combination group could markedly discrease the serum TC、TG、LDL-C(P<0.01), increase the the serum HDL-C(P<0.01); at the same time, the combination group could enhanced the serum adiponnectin (P<0.01), and reduce serum leptin markedly(P<0.01). In addition, the rising role of the combination group on serum adiponnectin was signficiantly better than Gynostemma pentaphyllum of total glucoside group or simvastatin group solely. Conclusion:The therapeutics of Gynostemma pentaphyllum of total glucoside combined with western medicine has a dramatical role in treating hyperlipemia.【Keywords】Gynostemma pentaphyllum of total glucoside Tablets;simvastatin;Hyperlipemia;Combination therapy 随着经济发展,我国国民饮食结构由以粮食和蔬菜为主转变成高脂肪、高蛋白、高热量的三高饮食,高脂血症成为常见病,由此导致的冠心病、动脉粥样硬化以及脑血栓等心脑血管疾病也已成为严重威胁人类健康的主要疾病。
高脂血症大鼠模型几种造模方法的比较孙赫;李文雄【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】通过4种具有代表性的造模方法诱导高脂血症大鼠模型,筛选出理想的高脂血症造模方法。
将健康SPF级雄性SD大鼠50只随机平均分为空白组、模型组Ⅰ~Ⅳ。
空白组正常基础饲料喂养;各模型组分别采用高脂饲料喂养和高脂乳剂灌胃法诱导造模,模型组Ⅰ:基础饲料59%+食用油15%+蛋黄粉10%+蔗糖10%+胆固醇6%;模型组Ⅱ:基础饲料56.8%+食用油15%+蛋黄粉10%+蔗糖10%+胆固醇6%+胆酸钠2%+丙基硫氧嘧啶0.2%;模型组Ⅲ:正常饲料喂养配合高脂乳剂灌胃(高脂乳剂配方:吐温60%+食用油15%+胆固醇6%+胆酸钠2%+丙基硫氧嘧啶0.2%);模型组Ⅳ:一次性腹腔注射维生素D360万单位/kg后,饲养与灌胃方法同模型组Ⅲ。
在造模10、20、40 d时经大鼠眼眶静脉丛取血,提取血清,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)并计算肝指数水平。
其中模型组Ⅱ、模型组Ⅲ和模型组Ⅳ均出现血脂代谢紊乱,肝指数明显升高(P <0.05),提示高脂血症模型构建成功,且模型组Ⅳ造模周期明显较模型组Ⅱ、Ⅲ缩短。
%To screenr an ideal method which can build hyperlipidemia rat model out of different modeling methods,we divided 50 rats stochastically as the blank group,the model groupⅠ,the modelgroupⅡ,the model groupⅢ and the model groupⅣ,10 rats in each group.Except the blank group,four different mod-eling methods were usedto build hyperlipidemia rat models.GroupⅠ:basal diet(5 9%)+ edible oil(1 5%)+ yolk powder(10%)+ sucrose (10%)+ cholesterol(6%);Group Ⅱ:basal diet(56.8%)+ edible oil (15%)+ yolk powder(10%)+ sucrose (10%)+ cholesterol(6%)+ sodium cholate(2%)+ propyl-thiouracil(0.2%);Group Ⅲ:normal diet respectively with intragastric administration of fat emulsion (fat emulsion formulation:Tween(60%)+ edible oil(15%)+ cholesterol(6%)+ sodium cholate(2%)+propylthiouracil(0.2%));Group Ⅳ:before in tragastric administration of fat emulsion-the same as model group Ⅲ,give an intraperitoneal injection of vitamin D3 60 000 U/kg.We took the orbital venous plexus blood of all the rats in 10 d,20 d and 40 d,isolated sera then detected the levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C by ELISA,and detected the levels of body weights and the liver indexes of rats in each group.The results showed that rats became hyperlipoidemic in groups Ⅱ,ⅢandⅣ,and the hyperlipidemia model was formed pared with model group Ⅱ and group Ⅲ ,the modeling time of group Ⅳ was sig-nificantly reduced.【总页数】5页(P78-82)【作者】孙赫;李文雄【作者单位】广州中医药大学第三临床医学院,广东广州 510405;广州中医药大学第三临床医学院,广东广州 510405【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.大鼠实验性高脂血症两种造模方法的比较 [J], 张智;闪增郁;向丽华;陈燕萍;李爽姿;张雪亮2.大鼠实验性高脂血症五种造模方法的比较 [J], 张东;武海军;陈士萍;应康;杨玉梅3.大鼠与家兔高脂血症模型造模方法及特点的比较 [J], 柳玉霞;王学林;李树良;杨旭丽4.高脂血症大鼠模型几种造模方法的筛选及优化 [J], 孙赫;梁桂洪;林勇凯;黄宇新5.高脂血症大鼠模型4种造模方法的筛选及优化 [J], 吴栩;韦伟标;刘少斌因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
高脂血症大鼠模型几种造模方法的筛选及优化孙赫;梁桂洪;林勇凯;黄宇新【摘要】To filter an ideal method which can build hyperlipidemia rat model out of different modeling methods,we divided 40 rats stochastically as the blank group,the model Group Ⅰ,the model Group Ⅱ, and the model Group Ⅲ,and there were 10 rats in each group.Except the blank group,three different modeling methods were used to build Hyperlipidemia rat models in the other three model groups.GroupⅠ:high fat diet;Group Ⅱ:normal diet respectively with intragastric administrati onof fat emulsion;model Group Ⅲ:before intragastric administration of fat emulsion the same as model group Ⅱ,give an intraper-itoneal injection of vitamin D3 60 000 U/kg.We took the orbital venous plexus blood of all the rats both at the end of 1,3 and 5 weeks during the models,then detected the seral levels of TC,TG,HDL-C ,LDL-C, SOD,MDA,NO and MPO,and detected the levels of body weight and the liver index of the rats in each group.The results showed that the rats Group Ⅱ and model Group Ⅲ became hyperlipoidemic and the model of hyperlipidemia was formed pared with model Group Ⅰ and Group Ⅱ,the model-ing cycle of model group Ⅲ was significantly reduced,which saved the cost of the experiment,and was more stable.This study revealed that Group Ⅲ it is an ideal method of building hyperlipidemia rat model.%通过几种具有代表性的造模方法诱导高脂血症大鼠模型,观察实验性高脂血症模型大鼠血清SOD 活性、MPO、NO 和 MDA 含量水平,筛选出理想的高脂血症造模方法。
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4.其他皮下肿瘤小鼠小鼠或裸鼠同上,可采用人源肿瘤细胞,更加贴近实际12天(八)心血管疾病模型1. 动脉粥样硬化(高脂高胆固醇+维生素D喂养)兔高脂、高胆固醇饲喂兔造模,成膜后血脂变化显著,为伴高血脂症的动脉粥样硬化4月血管组织病理切片染色2. 主动脉粥样硬化(高脂高胆固醇+主动脉球囊损伤)兔此模型用大球囊损伤加高脂饲养方法成功建立兔主动脉粥样硬化狭窄的动物模型,为相关基础研究提供可靠模型。
2月动物实验模型病理切片展示一、CCl4诱导的肝脏纤维化简介:肝纤维化是肝细胞坏死或损伤后常见的反应,是诸多慢性肝脏疾病发展至肝硬化过程中的一个中间环节。
肝纤维化的形成与坏死或炎症细胞释放的多种细胞因子或脂质过氧化产物密切相关。
CCl4为一种选择性肝毒性药物,其进入机体后在肝内活化成自由基,如三氯甲基自由基,后者可直接损伤质膜,启动脂质过氧化作用,破坏肝细胞的模型结构等,造成肝细胞变性坏死和肝纤维化的形成。
通过CCl4复制肝纤维化动物模型通常以小鼠或大鼠为对象,染毒途径主要为灌胃、腹腔注射或皮下注射。
动物模型图. 经过3个月的CCl4注射造模,小鼠的肝脏在中央静脉区形成了比较明显的肝纤维化,中央静脉之间形成了纤维桥接。
(Masson染色)二、CXCL14诱导的急性肝损伤动物模型简述:CCl4是最经典的药物性肝损伤造模毒素之一,其在肝内主要被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢,产生三氯甲烷自由基和三氯甲基过氧自由基,从而破坏细胞膜结构和功能的完整性,引起肝细胞膜的通透性增加,可溶性酶的大量渗出,最终导致肝细胞死亡,并引发肝脏衰竭。
根据CCl4代谢和肝毒性机制可复制不同的肝损伤模型,其中给药剂量和给药方法是其技术关键。
实验动物习题库含参考答案一、单选题(共37题,每题1分,共37分)1.在大型实验动物饲养场,为了防止由于引种带入新的病原菌,多采用________的方式引种。
( )A、引入新出生的动物B、引入冷冻胚胎C、引入即将可以配种的动物D、引入剖腹产动物正确答案:B2.在生物医学研究中使用量最大的动物为______。
( )A、豚鼠B、大鼠C、小鼠D、犬正确答案:C3.BALB/c小鼠属于______动物。
( )A、无菌动物B、杂交群动物C、封闭群动物D、近交系动物正确答案:D4.生物洁净技术设施对通风系统有如下特性和要求,以下哪个叙述是不正确的 ( )A、室外进风口、排出口为了防止雨. 风沙等倒灌以及鸟类飞进. 应设有百叶格,风帽或铝板网。
B、排风管口不应装有回阀或防风过滤机组,以防室外不洁净空气流人洁净设施内。
C、用于感染性研究洁净设施. 如传染性病毒细菌动物实验研究的设施的择风口应设置病毒、细菌等传染病菌吸附处理装置。
D、应有效排除洁净设施内的气味和气体,且具有舒适性。
一般生物洁净技术设施内通风系统设置为顶送. 底部对称侧排. 不提倡顶送顶排。
正确答案:B5.设施符合动物居住的基本要求,不能完全控制传染因子,适用于饲育教学等用途的普通级实验动物,该环境是______。
( )A、半屏障环境B、普通环境C、隔离环境D、屏障环境正确答案:B6.________几乎没有汗腺,夏天靠加快呼吸来散热。
( )A、地鼠B、犬C、小鼠D、大鼠正确答案:B7.根据我国国家技术监督局发布的实验动物环境设施监测标准,犬、兔动物实验实施(使用型)普通环境指标中,(静态)温湿度是______。
( )A、温度16~26℃、相对湿度50-60%B、温度18~22℃、相对湿度40-70%C、温度16~26℃、相对湿度40-70%D、温度18~22℃、相对湿度50-60%正确答案:C8.长爪沙鼠属于________。
( )A、食肉目B、啮齿目C、爬行纲D、灵长目正确答案:B9.清洁级大、小鼠配合饲料中维持饲料常规营养成分为______。
银丹心脑通软胶囊与运动联合应用对动脉粥样硬化大鼠的防治作用研究该研究的目的在于探索银丹心脑通软胶囊(YDXNT)与运动(游泳)联合作用后对动脉粥样硬化大鼠的预防作用?主要采用二因素(YDXNT,游泳)三水平(0,1,2 g·kg-1 YDXNT ;0,0.5,1 h游泳)3×3析因设计?结扎大鼠左颈总动脉造成狭窄,然后喂养高脂饲料,建立大鼠动脉粥样硬化模型?8周后,胸主动脉采集血液测定其全血黏度?血浆黏度?纤维蛋白原(FIB)?血清一氧化氮(NO)?血浆6-酮-前列腺素1α(6-keto-PGF1α)? 内皮素(ET)?血栓烷素B2(TXB2)水平?取大鼠左颈总动脉组织,进行免疫组织化学染色,观察蛋白SM22α的阳性表达,并对其进行半定量?结果发现,YDXNT结合游泳可以显著降低血浆黏度(F=3.241,P=0.017)?高?低切全血黏度(分别为F=6.444,P=0.001;F=3.002,P=0.024)和FIB (F=4.046,P=0.005)?在升高血清NO,血浆6-keto-PGF1α,降低血浆ET,TXB2方面,交互作用显著(P<0.05)?游泳对于上调蛋白SM22α的表达主效应明显(F=8.088,P=0.001)?该研究提示银丹心脑通软胶囊结合游泳运动后能够改善动脉粥样硬化大鼠的血液流变学指标,具有内皮保护作用,可抑制动脉粥样硬化中的血管重构,对于动脉粥样硬化有积极的预防作用?标签:银丹心脑通软胶囊;动脉粥样硬化;运动;血液流变学;内皮保护;血管重构动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多因素疾病,其发病机制复杂?它不仅是动脉自身的疾病,也是导致心肌梗塞和脑梗塞的主要原因,是世界范围内发病率和病死率较高的心血管类疾病的主要病因,在发达国家称之为“头号杀手”,且近年来在我国的发病率呈上升趋势[1]?大量的研究表明AS好发于人体动脉系统如血管分叉处?弯曲处?血管狭窄处这样一些血管几何形状发生急剧变化的部分,血流剪应力是AS发生的始动病理因子,在AS的病理进程中发挥重要作用?银丹心脑通软胶囊(YDXNT)是根据苗族医学“两病两纲”理论研制的复方制剂,由银杏叶?丹参?绞股蓝?灯盏细辛?大蒜?三七?山楂?天然冰片8味中药组成,具有活血化瘀?行气止痛?消食化滞等功效?本研究的前期工作已经证实,银丹心脑通软胶囊与游泳结合后能够改善AS大鼠血脂,病理组织观察也显示两者联合应用后,可改善AS斑块,减小病变的面积?但两者预防AS大鼠的作用靶点及机制尚不清楚?因此,本实验研究两者联合作用对AS大鼠血液流变学?血管内皮保护以及血管重构相关蛋白表达的影响,进一步阐释两者联合作用的机制,为银丹心脑通的临床合理应用提供科学依据?1 材料1.1 动物健康雄性SD大鼠80只,体重(210±20)g,由军事医学科学院实验动物中心提供,合格证号SCXK(军)2007-004?1.2 药品银丹心脑通软胶囊(贵州百灵企业集团制药股份有限公司,批号20120214)?1.3 试剂10% 水合氯醛;硫酸庆大霉素注射液(天津药业焦作有限公司,批号12051621);维生素D3(上海通用药业股份有限公司,批号101204);FIB试剂盒(批号136042)购自上海太阳生物技术有限公司;SM22α兔源多克隆抗体(abcam公司,货号ab14106);免疫组化二步法试剂盒(BOSTER);DAB显色剂(BOSTER);PBS(BOSTER);Mayor′s苏木素(BOSTER);中性树胶(国药集团化学试剂有限公司,批号20130509);二甲苯(北京化工厂,批号20130108);无水乙醇(北京化工厂,批号20130327);95%乙醇(北京化工厂,批号20130401);一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20130624);内皮素(ET)放免试剂盒(批号20130620)?6-酮-前列腺素1α(6-keto-PGF1α)放免试剂盒(批号20130620)?血栓烷素B2(TXB2)放免试剂盒(批号20130620)均购于北京北方生物技术研究所?1.4 仪器MP100A-CE型多通道生理记录仪(美国BIOPAC System 公司);LBY-N6K 自动血液流变仪?血凝仪C2000-4(北京普利生仪器有限公司);MK3酶标仪(thermo公司);BX51型光学显微镜?DP72型相机?DP2-BSW图像分析软件(奥林巴斯公司,日本)?2 方法2.1 大鼠颈总动脉狭窄模型的制备手术组大鼠于左颈总动脉处做结扎手术,参考Shi Fang Ding[2]和Douglas Nam[3]等的方法:大鼠用10% 水合氯醛(0.3 g·kg-1)麻醉,颈部备皮消毒后正中切口,逐层分离,游离出左颈总动脉,首先在总动脉处环绕一条结扎线,与总动脉平行放置一根外径为0.30 mm的针,在距总动脉分叉1.5 cm处把针头与动脉系紧,然后快速的拔出针,结扎线保留于总动脉上,最后复位缝皮,并于腿部肌肉注射硫酸庆大霉素注射液0.7 mL?假手术组只分离出总动脉,不做结扎,其余同?手术前后用多通道生理记录仪测定大鼠颈总动脉的血流量,计算狭窄率,以检测大鼠颈总动脉血管狭窄模型成功与否?2.2 析因设计实验分组手术后,正常饲料喂养5 d,期间,按6×105 U·kg-1腹腔注射VD3,连续3 d?5 d后,手术组大鼠高脂饲料(1% 胆固醇?0.2% 猪胆盐?10% 猪油?10%蛋黄粉?78.8% 基础饲料)喂养,并同时实施3×3析因设计的干预因素,连续8周?假手术组喂养正常饲料,不加任何措施?给药与运动训练:0 g·kg-1 (不给药);1,2 g·kg-1(银丹心脑通软胶囊内容物按照相应给药的浓度用纯净水配成悬液,灌胃给药,每天1次,连续8周)?0 h游泳组(不游泳);0.5 h游泳组(从第1天游泳10 min训练开始,然后每天增加10 min,至每日游泳30 min后,持续8周);1 h游泳组(同0.5 h游泳组进行训练,至每日游泳60 min后,持续8周)?析因设计干预措施详见表1?2.3 观察指标2.3.1 样本采集第8周末,大鼠用10%水合氯醛,0.3 g·kg-1麻醉,分离腹主动脉取血,分别依次抽取3管,其中,第1管加肝素钠抗凝,用于血液流变学指标的测定;第2管加7.5% EDTA二钠和抑肽酶抗凝,用于内皮因子ET,6-keto-PGF1α,TXB2的测定;最后一管不加抗凝剂,离心分离得血清,用于NO 的测定?采血结束后,自左颈总动脉分叉向下2 cm处,剥离结缔组织,生理盐水冲洗干净,固定于4% 多聚甲醛溶液中,预备免疫组织化学蛋白测定?2.3.2 血液流变学指标的测定全血黏度及血浆黏度的测定采用旋转法,纤维蛋白原(FBI)按照试剂盒方法测定?评价不同组对血液流变学的影响?2.3.3 内皮相关因子测定放射免疫法测定血管活性物质ET,6-keto-PGF1α,TXB2;化学法测定一氧化氮(NO),以评价各组内皮保护功能?2.3.4 血管重构相关蛋白的测定采用免疫组织化学的方法测定SM22α在大鼠颈总动脉中的表达情况?阴性对照组用PBS代替一抗SM22α,其余同?2.3.5 免疫蛋白染色结果分析免疫组化染色结果评定标准:无着色为阴性,淡黄色为弱阳性,棕黄色为中等阳性,深棕黄色为强阳性?应用OL YMPUS图像分析系统,高倍镜下(×200)下观察血管壁,随机选取3~5个视野,图像采集后,用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定阳性产物的IOD(代表阳性表达强度),用SM22α阳性相对表达量进行半定量分析,各组结果以±s表示?SM22α相对阳性表达量:测量SM22α阳性表达区域吸光光密度值(IA),然后与阴性对照的IA相比,得出相对阳性表达量,用以比较各组间SM22α阳性表达量的差异?2.3.6 数据统计分析数据均以±s表示,假手术组与模型组的差异,统计采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析,组间比较采用LSD法;析因设计的9个处理组比较采用双因素方差分析,协同作用的统计分析采用GLM?P<0.05被认为有显著性差异或交互作用明显?3 结果3.1 对血液流变学指标的影响与假手术组相比,模型组(Group 1)血浆黏度?(高?低切)全血黏度?FIB 均显著增高(P<0.05,0.01)?YDXNT与运动结合对血液流变学4个指标都显示明显交互作用(P<0.05)?与模型组相比,所有作用组都显示可降低血浆黏度?高低切全血黏度,其中,Group 7对血浆黏度?高切(200 s-1)全血黏度的作用优于其他组;Group 7对低切(10 s-1)全血黏度的作用优于其他组?而对于FIB的影响,只有Group 3,6,8,9这4组显示降低FIB的含量,见表2?其双因素方差分析结果见表3?3.2 对血管内皮细胞功能的影响与假手术组相比,模型组NO(P<0.05)和6-keto-PGF1α含量降低,ET(P <0.05)和TXB2(P<0.05)含量升高?YDXNT和游泳联合应用在升高NO,6-keto-PGF1α水平与降低ET,TXB2水平方面,交互作用显著(P<0.05)?YDXNT 对NO主效应影响显著(F=37.360,P=0.000),且2 g·kg-1的YDXNT作用优于1 g·kg-1的YDXNT?对于ET的影响,除Group 4外,其余7组都不同程度降低ET的含量,Group 7降低最明显?对于TXB2的影响,则游泳起主导作用(F=8.018,P=0.001)?对于6-keto-PGF1α的影响,除Group 9组,其余都显示不同程度的升高,Group 7作用优于其他组,见表4?其双因素方差分析结果见表5?3.3 对血管重构相关蛋白表达的影响3.3.1 血管重构相关蛋白表达的定性分析结果观察免疫组织化学染色结果发现:与假手术组相比,模型组血管平滑肌层几乎未见棕黄色?与模型组相比,干预组呈现不同程度的棕黄色,见图1?3.3.2 血管重构相关蛋白的半定量分析结果结果显示与假手术组相比,模型组(Group 1)的SM22α相对阳性表达量明显减小(假手术组5.27±0.94;模型组3.20±0.87),且具有统计学意义(P<0.01),见图2?蛋白SM22α的相对表达量统计结果显示游泳与YDXNT无明显的交互作用(F=1.632,P=0.175),但单独的游泳显示明显的主效应(F=8.088,P=0.001)?与模型组相比,不游泳组(Group 4,7)SM22α相对阳性表达量有轻微增加(模型组 3.20±0.87;Group 4 为3.47±1.72;Group 7 为3.21±0.79)?与0.5 h游泳结合时,3个YDXNT浓度对于SM22α蛋白的相对阳性表达都有不同程度的增高(分别为4.67±1.07,4.58±1.74,4.89±2.22),其中与2 g·kg-1的YDXNT结合作用较优?与1 h游泳结合时,3个浓度的YDXNT不仅升高SM22α且有统计学差异(分别为4.97±2.74,5.97±2.05,4.07±1.81),见图2?4 讨论AS导致的心?脑血管疾病是危害人类的主要疾病,其发病率和病死率均居各类疾病的首位?现在多认为AS是由于脂质代谢紊乱?炎症反应?氧化应激?内皮损伤等多种因素综合作用引起的血管退行性病变?其发生发展过程中伴随着血管内皮细胞功能的障碍?巨噬细胞的炎症反应与聚集?平滑肌细胞的增殖和迁移等一系列病理变化?大量的研究表明,生物力学因素在AS的病理生理及防治过程中同样起着重要作用,而血流剪切应力的作用被认为是最重要的因素[4]?低剪应力作用下,血管内皮细胞中某些促炎因子及凋亡基因表达上调,激活相应信号转导通路,参与诱导凋亡?细胞迁移?白细胞黏附等作用,导致AS的形成[5]?从中医角度来看,动脉粥样硬化(AS)是一种由心脾肾的亏损,导致气滞血瘀,痰积内生,脉络不通的全身性疾病,治疗以活血化瘀?软坚散结?消食化痰?通腑化浊为主[6]?虽然西药在治疗AS中机制明确,取得了显著效果,但其作用往往效果单一,且副作用较大?中药复方以中医理论为指导,从整体作用出发,具有多靶点?多通路等独特优势,很大程度上弥补了现代医学的不足?因此,本项研究将中药复方YDXNT与游泳结合后作用于AS大鼠,结果发现两者联合作用在降低血液流变学指标血浆黏度?高低切全血黏度?FIB方面,升高血管内皮舒张因子NO,6-keto-PGF1α及降低血管内皮收缩因子ET,TXB2方面都有明显的交互作用,提示YDXNT与运动结合后可能通过调节血流剪应力及保护内皮,起到抗AS的作用?血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型转化是血管重塑性疾病的共同病理生理过程?SM22α是近年发现的一种分化标志蛋白,在分化型VSMCs中大量表达[7],随着血管重塑过程中VSMCs由收缩性向合成型转化,其表达量明显降低?Feil 等的研究结果证实SM22α可通过抑制VSMCs由收缩型向合成型转化而抑制AS 斑块的生长[8]?另有研究显示低血流剪应力可以促使早期动脉壁的结构性重建[9],这说明血流剪应力因素对于血管重构起着关键作用,本研究的结果显示YDXNT与游泳联合作用可以升高SM22α的表达,其中,游泳的主效应明显?这一结果说明YDXNT与游泳影响血管重构具有协同作用,其可能通过改变血流动力学因素,抑制AS大鼠血管重构中VSMCs的表型转化,进而抑制AS的发展?综上所述,YDXNT与游泳联合应用具有抗AS作用,其机制可能是通过调节血流剪应力?保护内皮细胞,抑制血管发生重构,从而影响AS的发展过程,起到抗AS作用?[参考文献][1] 杨永宗. 动脉粥硬化性心血管病基础与临床[M]. 2版.北京:科学出版社,2009:28.[2] Ding S F,Ni M,Liu X L,et al. A causal relationship between shear stress and atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice assessed by ultrasoundbiomicroscopy [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2010,298:2121.[3] Nam D,Ni C W,Rezvan A,et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow,leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,297:1535.[4] 周淑媛,王迎寒,巩仔鹏,等. 颈总动脉套管法与颈外动脉结扎法建立局部低切应力动脉粥样硬化兔模型的比较[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(10):166.[5] Zaragoza C,Márquez S,Saura M. Endothelial mechanosensors of shear stress as regulators of atherogenesis [J]. Curr Opin Lipidol,2012,23(5):446.[6] 王椿野,赵振武,李新龙,等. 基于现代文献的动脉粥样硬化中医病机研究[J].环球中医药,2013,6(2):92.[7] 史建红,温进坤,韩梅. SM22α在细胞骨架组构及血管重塑中的作用[J]. 生理科学进展,2006,37(3):211.[8] Feil S,Hofmann F,F eil R. SM22α modulates vascular smooth muscle cell phenotype during atherogenesis[J]. Circ Res,2004,94:863.[9] 郭子义,血流切应力变化对大鼠颈总动脉重建的影响及其机制[D]. 上海:上海交通大学,2007:33.Study on preventive and therapeutic effects of combined application ofYindanxinnaotong soft capsule and exercise on atherosclerotic ratsWANG Jian-lu,WANG Lan,CHENG Long,YIN Xiao-jie,XU Hai-yu,WANG Wan-dan,LIANG Ri-xin(1. Institute of Chinese Materia Medica,Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100700,China;2. Medicinal Plant Research Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100193,China;3. College of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100069,China)[Abstract] To explore the prevention effect of the joint combination of Yindanxinnaotong soft capsule (YDXNT)and exercise (swimming)on atherosclerotic rats. The method of 3×3 factorial design,including two factors (YDXNT and swimming)and three levels (0,1,2 g·kg-1 YDXNT;0,0.5,1 h swimming),was mainly adopted. The atherosclerotic rat model was establishedby ligating their left common carotid arteries and feeding high-fat diet. After 8 weeks,blood samples were collected from their thoracic aorta to determine blood viscosity,plasma viscosity,fibrinogen (FIB),nitric oxide (NO),6-keto-PGF1α,endothelin (ET)and thromboxane B2 (TXB2).The tissues of left common carotid arteries of the rats were collected to detect the positive expression of SM22α and determine the semi-quantitation through the immunohistochemical staining. The result showed that the combination of YDXNT and swimming can significantly decrease the plasma viscosity (F=3.241,P=0.017),the high and low shear blood viscosity (F=6.444,P=0.001;F=3.002,P=0.024)and FIB (F=4.046,P=0.005). The increased NO and 6-keto-PGF1α and the decreased ET and TXB2indicated a significant interaction (P<0.05). The swimming showed an obvious main effect in the expression of up-regulated protein SM22α(F=8.088,P=0.001). The study suggested that the combined administration of YDXNT and swimming could improve the hemorheological parameters of atherosclerotic rats,protect the vascular endothelium,inhibit the vascular remodeling in atherosclerosis and positively prevent the atherosclerosis.[Key words] Yindanxinnaotong soft capsule;atherosclerosis;exercise;hemorheology;endothelial protection;vascular remodelingdoi:10.4268/cjcmm20141337。