粗糙集_比较残基相互作用分析法研究HIV整合酶抑制剂的构效关系_刘浩

DOI：10.3969/j.issn.1672-7878.2013.03-001网络出版时间：网络出版地址：药效团技术在抗感染新药研究中的应用*1肖静*2，房咪，陈姣，郑珩*3中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009【摘要】药效团(pharmacophore)是指药物分子中对活性起重要作用的“药效特征元素”及其空间排列形式。

药效团技术作为1种发展迅速的计算机辅助药物设计方法，已广泛应用于虚拟筛选、全新药物设计、先导化合物优化和ADMET预测等新药的设计和研发过程中，可提高药物研发的成功率，降低研发成本，缩短研发周期。

近年来，禽流感、甲流感及超级细菌等新型传染性疾病的出现，为抗感染新药研发提出了新的挑战，为此，综述近年来国内、外发表的有关药效团模建技术的研究进展及其在抗感染新药研发中应用的文献以促进计算机辅助药物设计手段在抗感染新药研发中的应用。

【关键词】药效团；抗感染；虚拟筛选【中图分类号】R965.1【文献标志码】A【文章编号】1672-7878(2013)03-161-006Application of Pharmacophore Modeling inAnti-infectious Drug Discovery*1XIAO Jing*2，FANG Mi，CHEN Jiao，ZHENG Heng*3School of Life science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing210009ABSTRACT Pharmacophores are defined as an arrangement of molecular features or structural elements related to biological activity.Pharmacophore as a rapidly developed computer aided drug design method has been successfully and extensively applied in novel drug research and development，such as virtual screening，de novo design，leads optimi-zation and so on.It can effectively reduce the cost and time in drug development，as well as improve the success oppor-tunity.The recent outbreak of novel infectious diseases as avian influenza，swine flu and superbugs makes it new chal-lenge of new anti-infectious drug discovery.In this review，based on the recent published papers，the development of pharmacophore modeling technique is summeried as well as its application in novel drug discovery is described in order to prompt the application of CADD methods in anti-infectious drug discovery.KEY WORDS pharmacophore;anti-infectious;virtual screening[Anti Infect Pharm，2013，10(3):161-166]每1种新药的成功研发需要耗费相当长的时间和大量人力物力，如最近FDA批准的Xa抗凝药，从生物靶标发现（1970s）到新药IND进入临床（1990s）到最终获准批文（2010年）足足用了40年[1]。

HIV-1整合酶抑制剂三维构效关系研究的开题报告
一、研究背景
建立良好的三维构效关系模型对于新药物研究和设计有着重要的意义。

HIV-1是一种导致艾滋病的病毒，其中整合酶是HIV-1繁殖过程中不可或缺的酶。

因此，开发HIV-1整合酶抑制剂是治疗艾滋病的重要策略
之一。

三维构效关系模型在HIV-1整合酶抑制剂的研究中具有重大意义。

二、研究目的
本研究旨在构建HIV-1整合酶抑制剂的三维构效关系模型，以预测
化合物的活性和优化药物设计。

三、研究内容
1. 收集已知的HIV-1整合酶抑制剂数据和化合物结构；
2. 构建HIV-1整合酶抑制剂的分子对接模型，确定复合物构象；
3. 利用药物设计软件，分析分子结构和活性之间的定量关联，建立
三维构效关系模型；
4. 对模型进行验证和优化，以提高预测准确性并指导新药物的设计。

四、研究意义
本研究的结果将为HIV-1整合酶抑制剂的研究和设计提供重要参考，加快新药物研发进程，有望为艾滋病的治疗提供更有效、更安全的药物。

同时，本研究所采用的方法和技术也可应用于其他药物的研究中，具有
普适性和推广价值。

以HIV-1整合酶为靶标的杂环并吡啶类衍生物的设计、合成及其构效关系研究艾滋病是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的简称,是一种对人类健康有着严重威胁性的重大传染病。

自从1981年6月在美国首次发现艾滋病患者到2015年底,这种疾病已导致三千多万人死亡。

目前,高效抗逆转录病毒联合疗法(HAART)是艾滋病的最佳治疗方法,但由于HIV病毒的迅速变异能力,导致耐药性病毒株以及药物的毒副作用使得寻找新的治疗药物成为该研究领域亟待解决的问题。

HIV的pol基因编码病毒复制过程中所需要的三个关键酶:逆转录酶,蛋白酶和整合酶。

整合酶是一个32kd的蛋白,作用是催化病毒DNA整合到宿主DNA上。

由于人体内不存在这样功能或者与其同源性较高的酶,因而HIV整合酶是一个理想的抗HIV药物设计靶标。

从2007年起已有三个整合酶抑制剂陆续上市:雷特格韦、埃替格韦和德罗格韦。

但是由于HIV的高突变性,对这些已上市药物有着耐药性的毒株也相继出现,这使得寻找新的治疗药物变得更为迫切。

本研究通过药效团研究和生物电子等排等原理,在已报道化合物的基础上设计了三种全新的先导化合物母核。

通过在所设计的母核上连接不同的取代基团而设计并成功合成了三个系列衍生物,且分别在分子水平和细胞水平对所设计合成的化合物进行活性测定。

最后利用分子对接方法研究这些化合物结构与HIV整合酶相互作用的模式以及抑制活性之间的关系,并分析得到了这些化合物活性差异的原因,期望以此为基础设计和合成出活性更好的整合酶抑制剂。

本论文内容主要包括以下几个方面:(1)结合已上市的三种整合酶抑制剂和三种N-羟基类整合酶抑制剂的结构特点,而设计出咪唑并哌啶类(J1-10a~J1-10s)和噻唑并哌啶类化合物(J2-12a~J2-12s),并通过在C-12位引入各种疏水芳香基团来探讨活性与结构之间的关系,为避免化合物设计不合理的问题,用分子对接程序对这两类化合物中的代表物进行了结合模式、对接能量和抑制活性的分析和预测。

HIV-1整合酶抑制剂筛选及其活性检测方法研究的开题报告一、研究背景人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是导致艾滋病的主要致病原。

目前，艾滋病已经成为全球性公共卫生问题，严重危害人类健康。

目前，虽然已经发展出了多种治疗方法，但是并没有找到能够彻底根治艾滋病的方法。

因此，研究HIV-1抑制剂成为治疗艾滋病的重要途径之一。

HIV-1整合酶在病毒生命周期中发挥重要作用，因此成为抗艾滋病药物研究的一个重要靶点。

目前已经发现了多种HIV-1整合酶抑制剂，这些抑制剂可以抑制整合酶的活性，从而抑制病毒复制。

二、研究目的和意义本研究的目的是筛选并检测HIV-1整合酶抑制剂的活性。

通过筛选出具有较高活性的抑制剂，为治疗艾滋病提供新的药物选择，并推动我国抗艾滋病药物的研发和进步。

三、研究内容1.构建含有HIV-1整合酶基因的表达载体；2.在细胞系中表达HIV-1整合酶；3.筛选并合成多个潜在的HIV-1整合酶抑制剂；4.对合成的化合物进行初步的活性筛选；5.运用不同浓度的化合物进行活性测定，并计算IC50值；6.通过分子对接和分子模拟技术，进一步探究抑制剂与整合酶的相互作用机制。

四、研究方法1.构建含有HIV-1整合酶基因的表达载体。

将HIV-1整合酶的coding序列克隆到表达载体中；2.在293T细胞系中表达HIV-1整合酶。

将表达载体转染到293T细胞系中，利用Western blot或者ELISA等技术检测HIV-1整合酶的表达水平；3.合成多个潜在的HIV-1整合酶抑制剂。

对一些潜在的化合物进行合成或从已知的小分子库中筛选出具有潜在抑制酶活性的化合物；4.对合成的化合物进行初步的活性筛选。

通过酶活性分析或细胞实验等技术对化合物的抑制活性进行初步筛选；5.运用不同浓度的化合物进行活性测定，并计算IC50值。

采用不同浓度的化合物作用于HIV-1整合酶，使用荧光素酶反应或放射免疫反应等技术，测定抑制率，进而推导出IC50值；6.通过分子对接和分子模拟技术，进一步探究抑制剂与整合酶的相互作用机制。

4 HIV21 整合酶的可溶性表达
为了筛选以整合酶为靶点的抑制剂 ,必须获得有活性
图 5 结构 2 ,L2708 ,906
化合物 ,该化合物在 ST 过程中表现出选择性抑制作用 ( IC50 值为 011μmol/ L) 。在 HIV 感染的 H9 细胞中 ,该化合物体 外抗 HIV 病毒的 EC50 值为2. 0μmol/ L [11] 。二酮酸基团与杂 环相连的一些化合物也具有抑制 ST 和抗 HIV 作用 。在这 一系列化合物中 ,最为引人关注的就是 S21360 (图 6) ,结构 3 (其抗 HIV21 整合酶的 IC50 值为 0102μmol/ L) [12] 。在 PBMC 细胞的抗 HIV 实验中 , S21360 具有很强的活性 ( EC50 值为 0114μmol/ L ;CC50 值为110μmol/ L ,其治疗指数 ( TI) 为 786) 。 S21360 具有抗体外变异活性 ,对 NRTI(核苷类逆转录酶抑制
药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2009 ,16 (3) :269～274
269
抗 HIV 整合酶抑制剂研究进展3
张 楠 ,张惠斌 ,黄 山
(中国药科大学药学院 ,南京 210009)
摘 要 H IV - 1 整合酶是 pol 基因在 3’2末端编码的相对分子质量为 32 000 的蛋白质 。H IV 的 DNA 整 合入宿主细胞染色体 DNA 的过程包括 DNA 特定序列的剪切 (3’2过程) 和接合 (整合) 反应 。病毒 DNA 整合入 宿主 DNA 的结束标志着 H IV 病毒感染人体细胞 (如 , T2细胞) 生物过程的完成 。目前为止 ,经 FDA 批准的通过 抑制 H IV21 整合酶来治疗艾滋病的药物只有一种 ,其他抗艾滋病药物均是以 H IV 逆转录酶和 HIV 蛋白酶为治 疗靶点 。为了全面了解 H IV21 整合酶抑制剂的研究方法和进展 ,对 H IV21 整合酶的结构 、功能 、克隆表达 、筛选 方法以及目前处于临床研究阶段的分子结构进行了详细阐述 。以 H IV21 整合酶的生物学功能为基础 ,理解了 目前整合酶抑制剂筛选方法的原理和应用 的 研究方向 。

艾滋病毒序列分析及比对研究随着科学技术的进步，人们对病毒基因的分析和比对研究也取得了显著的进展。

艾滋病毒是一种引起免疫系统衰竭的病毒，它对全球公共卫生产生了重大威胁。

通过对艾滋病毒序列的分析和比对研究，可以揭示其基因结构和进化规律，对病毒传播和抗病毒药物研究具有重要意义。

艾滋病毒基因组由RNA组成，包含包括gag、pol和env等基因。

其中，gag编码病毒的核心蛋白，pol编码病毒的逆转录酶和整合酶，env编码病毒的包膜蛋白。

这些基因在病毒的感染过程中起着至关重要的作用。

因此，对这些基因序列进行分析和比对是理解艾滋病毒生物学特性的关键。

针对艾滋病毒基因序列的分析和比对可以采用多种方法。

其中，常用的方法包括多重序列比对、Phylogenetic分析和序列统计学分析。

多重序列比对是在不同基因组中同时比对多个序列以找到相同区域的方法。

它可以帮助我们识别保守区域和变异区域，揭示基因序列的功能和进化。

比对结果可以用于构建基因树，分析不同基因和基因型之间的关系。

Phylogenetic分析有助于了解艾滋病毒的进化历史，确定不同亚型以及不同地理区域感染毒株之间的关系。

序列统计学分析可以从统计学的角度判断序列特征和表达规律。

通过计算序列中的碱基组成，可以帮助我们了解基因的生物学特性。

此外，我们还可以评估序列的相似性、差异性和匹配性等指标，以揭示病毒变异和突变情况。

在艾滋病毒序列分析和比对的研究中，还需要考虑到样本的数量和质量。

艾滋病毒是高度变异的病毒，不同亚型和亚型间的序列差异较大。

因此，在分析过程中应该选择一定数量的高质量样本，以获得可靠的结果。

此外，还需要专业的软件和算法的支持，以提高分析的准确性和效率。

通过艾滋病毒序列分析和比对的研究，我们可以揭示艾滋病毒的遗传特征、进化规律和传播方式。

这对疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

此外，对不同亚型和突变株的比对研究，也可以帮助我们更好地理解病毒的耐药性和抗病毒药物的设计。

推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号
科研热词 1 抑制剂 2 合理药物设计 3 hiv-1整合酶
推荐指数 1 1 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
2013年 科研热词 hiv-1 逆转录酶 整合酶抑制剂 整合酶 酶联免疫吸附 表面等离子共振 虚拟筛选 药物评价 药物设计 荧光共振能量转移 石斛属 核糖核酸酶h 构效关系 时间分辨荧光法 支持向量机 实时荧光定量pcr 定量构效关系 嘧啶酮 喹啉酮酸类衍生物 双靶点抑制剂 内生真菌 作用机制 二酮酸 临床前 hiv整合酶抑制剂 hiv-1整合酶抑制剂 hiv alphascreen 推荐指数 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7
科研热词 质粒 表型 点突变 整合酶类 抗药性,病毒 hiv整合酶抑制剂 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱiv-1
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1
2008年 序号 1 2 3 4
科研热词 整合酶 抑制剂 人类免疫缺陷ⅰ型病毒 rna干扰
推荐指数 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
科研热词 高通量检测方法 苯乙烯基喹啉磺酰胺衍生物 生物活性 整合酶核心区 整合酶抑制剂 整合酶 抗hiv药物 抗hiv 抑制剂 成熟抑制剂 去整合 raltegravir(mk-0518) perkin反应 hiv进入/融合抑制剂 hiv整合酶抑制剂 hiv-1整合酶 hiv-1 gs-9137 4-喹啉酮

图 1 抑制剂与整合酶核心区结合模式图 Fig.1 The binding mode of the inhibitors with
No.11
王存新等：用分子模拟方法研究 HIV鄄1 整合酶与咖啡酰基类抑制剂的相互作用
1231
Dell Power Edge 750 10 节点 PC Cluster 上实现. 1.5 结合自由能计算
由 MD 轨迹可以分析得到配体与受体结合状 态下以及配体在溶剂中与环境之间的静电相互作用 能和范德华相互作用能, 由表达式(1)、(2)可用 LIE 方法计算该类抑制剂与整合酶的结合自由能. 分别 采用对 茁 取 0.5, 仅优化 琢 的 Model 1, 同时对 琢 和 茁 的取值进行了优化的 Model 2, 以及加入一个常数 项 酌 的三参数模型 Model 3 计算结合自由能.
interaction energy, LIE)计算了 HIV鄄1 整合酶与咖啡 酰基和没食子酰基类整合酶抑制剂之间的结合自由 能, 并对自由能预测模型进行了改进.
1 模型和计算方法
1.1 LIE 自由能计算方法
LIE 方法是近几年来发展起来的一种基于分子
动力学采样的自由能计算方法. 这种方法把结合自
用 GROMACS 程序包[17]对 12 个复合物结构以 及 12 个抑制剂分别在水溶液中进行 MD 模拟. 12 个复合物结构取自分子对接得到的结构. 每个复合 物的质心置于立方体盒子中心, 选择溶质原子到盒 子壁的距离为 0.8 nm, 然后加入水分子, 水分子采 用SPC模型[18]. 采用GROMACS全原子力场, 分别用 最陡下降法和共轭梯度法进行了 200 步的能量优 化, 然后在 300 K 下进行了 1000 ps 的 MD 模拟. 模 拟采用 NTV 正则系综, 使用热浴耦合使系统温度 保持在300 K[19], 原子初始速度在300 K下用Maxwell 分布产生. MD 积分步长取 2 fs, 每隔 100 步记录一 次轨迹. 在模拟中, 静电相互作用采用 PME 算法, 范德华相互作用截断半径取 1.0 nm. 对所有 MD 模 拟后 800 ps 的轨迹进行结果分析. 分别对蛋白环境 和溶剂环境下抑制剂与环境之间相互作用能进行系 综平均, 从而计算结合自由能. 分子动力学模拟在

北京工业大学硕士学位论文用分子动力学和分子对接方法研究HIV-1整合酶与抑制剂的相互作用姓名：***申请学位级别：硕士专业：流体力学指导教师：***20040501摘要摘要近２０年来，计算机辅助辅助药物设计及其相关技术得到了广泛的应用，特别是在药物开发的过程中起着日益重要的作用。

应用各种理论计算方法和分子模拟技术，进行计算机辅助药物设计，已成为国际上十分活跃的科学研究领域。

本论文选取人体免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）整合酶为研究对象，用分子动力学（ＭＤ）模拟方法和分子对接方法研究其与己知抑制剂的结合模式，以及与ＤＮＡ可能的结合位点，为寻找具有更好活性的抗艾滋病药物提供帮助。

论文主要包括以下三个方面的工作：ＨＩＶ－１整合酶与抑制剂金精三羧酸（Ａｕｒｉｎ）复合物的分子动力学模拟；ＨＩＶｏｌ整合酶与抑制剂紫草酸（Ｍ５２２）和紫草酸Ｂ（Ｍ５３２）结合模式的研究：以及ＨＩＶ－１整合酶Ｃ端结构域与ＤＮＡ的结合位点研究。

Ｘ—ｒａｙ和ＮＭＲ实验已经给出了ＨＩＶ－１整合酶三个结构域的结构，这为基于受体结构的药物设计提供了条件。

通过将ＨＩＶ－１整合酶与已知的抑制剂Ａｕｒｉｎ小分子对接，我们得到了它们未知的复合物结构，然后对复合物进行了９５０ｐｓ的ＭＤ模拟，研究ＨＩＶ－１整合酶与Ａｕｒｉｎ的相互作用和结合模式。

ＭＤ模拟显示，对接的复合物结构稳定。

另外，根据ＭＤ模拟得到的整合酶与Ａｕｒｉｎ相互作用后的构象变化信息，将对接复合物结构进行了修正，在一定程度上消除了对按时受体保持刚性所带来的影响，经过修正的复合物预测结构更加合理和稳定。

本工作得到的ＨＩＶ－１整合酶与抑制剂Ａｕｒｉｎ的结合模式信息将有助于设计和改造出效果更好的抗ＨＩＶ－１整合酶的先导化合物。

Ｍ５２２和Ｍ５３２是从草本植物丹参（Ｓａｌｖｉａｍｏｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）中分离提取出来的水溶性成分。

它们是高效的抗ＨＩＶ－１整合酶抑制剂，体内和体外都能有效地抑北京工业大学工学硕士学位论文制ＨＩＶ－１的复制，并且在很高的浓度下，对Ｈ９细胞都没有毒性。

核苷类抗艾滋病药物的定量构效关系研究人体免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus-1,HIV-1）是艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）的病原体,是一种致死性传染疾病,通过入侵CD4⁺T细胞,最终使人体免疫系统崩溃。

计算机辅助药物设计（computer aided drug design,CADD）是一门化学、生物等学科交叉在一起的新兴学科,将CADD方法应用于现代制药,与新型药物研究合成结合起来,可以很大程度上节约成本、提高准确率、节省研究经费、加快新药研发的速度、提高医药行业的整体研究水平,而且对药物研究合成工作者提供理论指导作用。

本研究主要采用比较分子力场分析法（Comparative molecular field analysis,CoMFA）、比较分子相似因子分析法（Comparative molecular similarity indices analysis,CoMSIA）和分子全息定量结构关系法（Hologram quantitative structure activity relationship,HQSAR）对一系列抗艾滋病衍生物进行了分子活性构象选择、分子叠合、空间力场范围建立以及相应3D-QSAR 模型建立,根据等势图分析化合物结构与活性之间的关系,通过Topomer search 技术进行分子设计,最后使用分子对接来探索小分子配体和大分子蛋白之间的结合作用,研究结果可进一步用于设计更高活性的新型HIV-1逆转录酶抑制剂,为新药合成提供了理论参考。

本论文主要从以下五个方面进行研究:（1）采用基于R基团搜索的Topomer CoMFA方法对一系列喹诺酮羧酸类衍生物进行了建模分析,得到了稳定可靠的3D-QSAR模型,研究结果证明该方法建立的模型具有良好的预测能力。

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粗糙集理论简介及应用案例解析引言：在信息时代的背景下，数据的爆炸式增长给人们的决策和分析带来了巨大的挑战。

而粗糙集理论作为一种有效的数据分析工具，已经在各个领域得到了广泛的应用。

本文将对粗糙集理论进行简要介绍，并通过实际案例来解析其应用。

一、粗糙集理论的基本原理粗糙集理论是由波兰学者Pawlak于1982年提出的一种数据分析方法，它主要通过对数据集中的不确定性进行处理，从而提取出其中的规律和知识。

粗糙集理论的核心思想是基于近似和不确定性，通过构建等价关系和约简操作来实现对数据的分析。

二、粗糙集理论的应用案例解析1. 医学领域在医学领域，粗糙集理论可以用于辅助医生进行疾病诊断和预测。

例如，通过对患者的病历数据进行分析，可以建立一个疾病与症状之间的关联模型。

通过这个模型，医生可以根据患者的症状快速判断出可能的疾病，并采取相应的治疗措施。

2. 金融领域在金融领域，粗糙集理论可以用于风险评估和投资决策。

例如，通过对股票市场的历史数据进行分析，可以建立一个股票价格与各种因素之间的关联模型。

通过这个模型，投资者可以根据市场的变化预测股票的价格走势，并做出相应的投资决策。

3. 交通领域在交通领域，粗糙集理论可以用于交通流量预测和交通优化。

例如，通过对交通数据进行分析，可以建立一个交通流量与各种因素之间的关联模型。

通过这个模型，交通管理者可以根据不同的因素预测交通流量的变化，并采取相应的措施来优化交通。

4. 教育领域在教育领域，粗糙集理论可以用于学生评估和课程推荐。

例如，通过对学生的学习数据进行分析，可以建立一个学生能力与学习成绩之间的关联模型。

通过这个模型，教育者可以根据学生的能力评估学生的学习状况，并推荐适合的课程来提高学生的学习效果。

结论：粗糙集理论作为一种有效的数据分析工具，已经在各个领域得到了广泛的应用。

通过对数据集中的不确定性进行处理，粗糙集理论可以提取出其中的规律和知识，为决策和分析提供有力的支持。

HIV-1整合酶结构的研究进展Abstract: The full length of determined HIV-1 (Human immunodeficiency virus type 1) integrase plays key roles in the anti-AIDS drug design based on the structure of acceptor. The structure and function of HIV-1 integrase and the advances in three aspects, segment structures, full length of constructed multimer and homologic systems, were summarized. The application value of each representative system was evaluated to provide some guidance for the platform established for the drug design and screening of HIV-1 integrase inhibitors.Key words: HIV-1; integrase; structure; drug design自从1981年6月发现首例艾滋病患者以来,艾滋病在全球范围内迅速传播｡艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)｡中国大陆在1985年发现首例AIDS,AIDS在我国的流行经历了传入期､播散期,目前正处于高速发展期｡根据最近世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和联合国艾滋病规划署(UNAIDS,)的估算,截至2009年底,全球AIDS感染者已达3 500万人,其中成年人超过3 000万人,妇女和儿童超过1 900万人｡我国AIDS病毒感染者总数已接近100万人,并呈上升趋势,若不能有效控制,今后10年这一数字可能会成倍增长,形势十分严峻｡AIDS已成为威胁人类健康的大敌,对社会将造成巨大破坏｡I型人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)是引起AIDS的病源｡患者体内HIV-1致死CD4+细胞,干扰其正常功能,使患者免疫功能减弱,进而引发AIDS｡当前AIDS治疗的主要策略是联合使用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的高效抗逆转录病毒疗法(Highly active anti-retroviral therapy, HAART),又称“鸡尾酒疗法”｡尽管该策略在AIDS治疗上发挥了重要作用,但两类抑制剂存在较大的抗药性､高毒性及高价格｡临床上迫切需要寻找新的抗AIDS药物靶点[1,2]｡HIV-1整合酶(Integrase, IN)能介导逆转录病毒DNA整合到宿主细胞DNA中,整合过程包括两步反应[3]: 第一步是3’端加工(3’-end processing, 3EP),即IN切割并结合病毒DNA形成IN-病毒DNA复合物;第二步是链转移(Strand transfer, ST),即IN-病毒DNA复合物切割并结合宿主细胞DNA,将病毒DNA整合到宿主DNA中,并随着宿主DNA的复制而复制｡如果能抑制病毒DNA的整合过程,就防止了细胞被永久性的感染,而且人体细胞中没有IN的功能类似物,使得IN 抑制剂选择性很高,对于正常细胞毒性小,所以针对IN催化反应的抑制剂设计已经成为国际上抗AIDS药物研究的热点[4-6]｡2007年Raltegravir(MK20518)被批准为第一个抑制IN的新药,IN抑制剂的研究取得了重大突破[7,8]｡HIV-1 IN含288个氨基酸残基,大小为32 kD,由N-端结构域(N-terminal domain, NTD)催化核心结构域(Catalytic core domain,CCD)和C-端结构域(C-teminal domain, CTD)折叠而成｡NTD是由1~49位氨基酸残基组成的螺旋-转角-螺旋结构,内含一个不保守的HHCC锌指结构,功能上主要是促进酶的四聚化和增强酶的催化活性[9]｡CCD由50~212位氨基酸残基组成,含有混合的α/β结构(共5个β折叠和6个α螺旋),是IN参与催化反应的主要区域,含有核酸内切酶和聚核苷酸转移酶的酶切位点｡CCD结构上有高度保守的DDE酸性基序与二价金属离子(Mn2+或Mg2+),二者螯合共同构成IN的活性中心｡值得一提的是,这3个酸性关键残基分别分布在不同的结构段上,即β1无规卷曲和α4段｡另外,残基范围140~149的二级结构是一个较长的无规卷曲,该区域结构的充分柔性对于IN的催化是必须的[10]｡CTD由213~288位氨基酸残基组成,包含了5个反平行的β折叠,形成了一个β桶,在IN的3个结构域中保守性最小,功能上是参与结合非特异性DNA,稳定IN-DNA复合物结构[11]｡一般认为,单独的CCD就能进行简单的去整合反应,但是要完全实现3EP和ST反应,3个结构域缺一不可[12]｡近年来,HIV-1 IN结构的研究是一个热点问题,引起了很多研究者的重视｡有生物学家已经从蛋白质结晶以及突变试验等方面对IN的结构及催化功能进行了较为全面的研究,并取得了一定的成果｡分子模拟理论工作者则主要用结构模建､分子对接以及虚拟筛选等方面进行了一些较为系统的研究｡笔者从片段结构､聚集体模建和同源复合物体系的角度出发,将HIV-1 IN结构的最新研究进展进行了综述, 旨在为有效设计HIV-1 IN抑制剂提供参考｡1整合酶的片段结构由于HIV-1 IN溶解性较差,难以稳定结晶,迄今生物学家用X-ray和NMR试验方法仍未获得完整的IN单体结构,更不用说二聚体和四聚体｡但蛋白质数据库(Protein data bank, PDB)中目前已经有超过25个HIV-1 IN的片段结构｡这里将综述比较有代表性的HIV-1 IN片段结构,这些结构虽然仅是IN的片段结构,但是它们对于早期的科研以及全长IN模建中起着重要的作用[13,14]｡前面提到,作为聚核苷酸转移酶,HIV-1 IN含有2个金属结合区域,即结合Zn2+的NTD锌指结构和结合Mg2+或Mn2+的CCD,这些金属离子是酶催化所必须的｡Bujacz等[15]用X-ray试验首次获得了含双Mg2+的CCD晶体结构(pdb代码:1VSH)｡图1(A)给出了1VSH三维结构,其中用绿色Solid ribbon模式表示蛋白质部分,金属离子用黑色CPK模式表达,而DDE基序(Asp64,Asp121和Glu157)残基用粉红色Stick表示｡该结构的解析首先证明了IN催化中需要双金属参与的观点一致,另外,Mg2+､Mn2+､Zn2+､Ca2+以及Cd2+均可以结合到CCD活性口袋区中｡试验还表明,功能Loop区(残基138~149)的柔性是整合酶维持高活性所必须的｡由于有Mg2+位置的确定,将为后续的结构解析提供了较好的参照作用｡Goldgur 等[16]通过双突变F185K和W131E提高IN的溶解度,并把双突变IN在大肠杆菌中表达出来,然后用X-ray方法获得了到目前为止惟一的一个IN与其抑制剂1-(5-氯-吲哚-3-甲酸)-3-四唑基-1,3-丙二酮烯醇(5CITEP)的复合物结构(pdb代码:1QS4),分辨率是2.1?魡｡值得一提的是,IN部分由3个CCD组成｡图1(B)给出了1QS4中一个单体的三维结构,其中蛋白质和金属离子表示方法同图1(A),而DDE基序(Asp64, Asp116和Glu152)残基和5CITEP抑制剂分别用黄色Stick以及粉红色Ball-and-stick表示｡1QS4中Mg2+､DDE基序和抑制剂5CITEP高分辨率的结合模式,为后续基于IN结构的药物分子设计提供了有用结构信息｡多位点突变策略较大地提高了HIV-1 IN的溶解性,解析所得片段也逐渐变长｡Chen等[17]通过引入五点突变(C56S/W131D/F139D/F185K/C180S),首次解析出包含有CCD和CTD区域的HIV-1 IN片段的对称二聚体,分子外形是一个“Y”字形,残基范围是52~288,分辨率为2.8?魡(pdb代码:1EX4),结构详见图1(C)｡CCD和CTD之间靠27个氨基酸长度的α6螺旋(残基195~211)连接｡可以推测,两个较长的α6柔性臂可能在整合催化中起着结构域重定向作用｡值得一提的是,该结构是首次报道的多结构域IN体系,从结构上解释了IN四聚体存在的合理性｡两个CCD 间存在1个二体接触面,而两个CTD之间距离大约为55?魡｡试验表明,CTD有专一性结合DNA的特性,推测CTD在整合催化作用中,应该有参与结合､弯转甚至重定向病毒DNA的功能｡电势计算结果表明,IN二聚体中有一条沿B链CCD到A链CTD的狭长正电区域带,病毒DNA可能结合到该区域｡参与结合的氨基酸残基有B链的Lys159､Lys186､Arg187和Lys188以及A链的Lys211､Lys215､Lys219､Lys243､Arg263和Arg264,这点证明了结构完整性是IN发挥其催化功能的基础｡另外该课题组还解析一个单独CCD(残基范围52~212)结构,与1EX4的CCD部分完全吻合,进一步证明了1EX4结构的合理性｡Wang等[18]解析出了包含有NTD 和CCD区域的HIV-1 IN片段结构(pdb代码:1K6Y),形成了1对非对称的IN四聚体,CCD和CTD之间是靠一个高度无序链47~55连接,残基范围是1~212,结构详见图1(D)｡该结构给出了IN四聚体中NTD以及CCD的接触界面,是模建IN四聚体的基本模板,具体做法是与包含有CCD和CTD区域的片段叠合,结构衍生模建出全长的HIV-1 IN二聚体和四聚体｡为了提高溶解性以利于结晶,体系进行了三位点突变(W131D/F139D/F185K)｡结构分析表明,1K6Y每个CCD或者CTD与之前报道的单体三维结构十分吻合,而且CCD与1EX4的对应区域结构类似｡2完整聚集体模建研究体内及体外的一系列生物学试验研究[19]表明,有活性的HIV-1 IN是多聚体,而且病毒中也存在一些低聚体IN,推测IN在多聚体和低聚体之间有一个动态平衡｡但是IN活性多聚体亚基数目有待深入研究[20]｡基于PDB库中已有的IN片段结构,国际上已有很多小组用同源模建方法获得了全长IN二聚体和四聚体等结构｡Luca等[21]首次用同源模建方法搭建了一条完整的HIV-1 IN二聚体结构,并用ESCHER分子对接程序与一条含有27 bp的病毒DNA进行复合物预测,获得了IN 与病毒DNA的结合模式(pdb代码:1WKN)｡图2(A)给出了1WKN的三维结构,绿色及紫色Solid ribbon模式表示IN的两个单体,而病毒DNA用黄色Ring表示｡模建过程有5个步骤:①保留1QS4 晶体结构[16]中A､B链的CCD,去除其中的配体､结晶水及C链,并把 4 个缺失残基Ile141､Pro142､Tyr143和Asn144 依据1BIS[22]中B链的同源区域补全;②把晶体结构中两个突变残基F158K和W131E 替换为天然残基,得到的野生型CCD二聚体的A､B链分别包含一个Mg2+;③按照包含双金属离子与HIV-1 IN高度同源的鸟肉瘤病毒IN结构1VSH[15],将第二个Mg2+放置于A､B链相应的位置;④把双金属IN2核心区与PDB代码为1EX4[17]和1K6Y[18]的结构依次叠落以获得全长的IN2;⑤最后与1WJD[23]结构叠落补全缺失的47~55 号残基｡通过详细的接触残基分析,证明了搭建的全长IN 二聚体-病毒DNA复合物准确验证了一系列交叉偶联和突变试验｡Luca采用的病毒DNA是已经切除3’末端2个核苷酸的｡实际上,在生理状态下,病毒DNA先与IN结合后再发生3EP反应,随之IN和病毒DNA的构象将发生一定变化｡所以3EP反应前后的结合模式可能会有所不同,基于此,有学者也用Jackal程序搭建了全长的IN二聚体[24-26]｡并用Autodock程序获得了与8 bp以及27 bp病毒DNA(没有切除CA碱基)的复合物结构,发现随着病毒DNA长度的增加,HIV-1 IN2与病毒DNA的具有生物活性的结合模式出现的可能性相应增大｡并用分子动力学方法研究了复合物在水溶液中的构象变化｡结果表明,与未结合IN的病毒DNA相比,复合物中病毒DNA的结合区碱基构象变化较大,尤其是结合部位的小沟变宽｡最近,Wielens等[27]以及美国国家癌症研究中心Karki等[28]分别用同源模建的方法获得了全长的整合酶四聚体,并基于四聚体结构研究了整合酶与病毒DNA 可能的结合模式以及金属离子对结合的影响｡其中Karki等[28]提供了3个模建路径,得到3个模建结构｡模型1路径具体为:①保留1EX4(CTD+CCD)二体结构,去除水,用Sybyl补全缺失残基,而功能Loop区(残基138~149)用PDB库中1BL3结构[29]补全,CTD的部分走向用PDB库中1IHV结构[30]校准;②用PDB库中1WJA 结构[23]补全NTD部分,这样得到了全长IN二聚体;③与1K6Y四聚体[18]叠落,获得全长四聚体;④放置两个金属Mg2+在DDE口袋中,第一个手工放置,第二个参照1QS4结构[16]｡图2(B)给出了模型1结构｡模型2的路径与模型1的区别有两点:①NTD结构采用1K6Y结构[18]而不是1WJA[23];②两个Mg2+的位置参照1VSH结构[15],而非手动以及参照1QS4[16]｡图2(C)给出了模型2结构｡模型3的路径与模型2相近,只是模型3中CTD的部分走向未用PDB库中1IHV结构[30]校准,图2(D)给出了模型3结构｡Karki等[28]的研究成果首次给出了IN与病毒DNA及宿主DNA的识别结果,证明Glu152､Gln148和Lys156是结合病毒DNA 的反应部位(CA-OH3’)的关键残基;以及功能Loop区(残基140~149)主要是通过隔开病毒DNA和宿主DNA,从而起到稳定IN和复合物的作用｡Wielens等[27]还用GRID程序将一系列IN抑制剂对接到IN四聚体-病毒DNA-宿主DNA上,这些对接结果都与已有的试验信息相吻合,并且对IN与DNA结合模式提供了一些有用的信息｡Wang等[31]搭建了一个与Karki等[28]提供的类似全长的IN四聚体结构,首次定量考虑了金属离子对于IN与病毒DNA相互作用的影响;Ke等[32]利用PDB库中已有的片段结构,也搭建了一个IN四聚体,并把不同长度的病毒DNA对接到该平台中,结果表明,IN四聚体中有3个DNA结合区域,有两个应该是病毒DNA结合区,另一个是宿主DNA结合区｡3同源蛋白酶-DNA复合物结构在HIV-1的生命周期中,HIV-1 IN主要是将病毒DNA整合到宿主细胞染色体中,整个催化反应前提是IN与病毒DNA的特异性识别与结合｡在生理状态下,病毒DNA先与IN结合,随后发生3EP反应｡在药物设计中,如果知道HIV-1 IN与病毒DNA的结合位点,就可以有针对性地寻找阻断HIV-1 IN与病毒DNA结合的抑制剂,阻断HIV-1的复制过程｡尽管上面提到了Luca等[21]､Wielens等[27]和Karki 等[28]均搭建出IN-DNA模型,这些为HIV IN的催化机理以及IN抑制剂的合理设计研究提供了许多有益的信息,但是它们依然无法完全满足当前IN抑制剂设计工作的需要｡因为在以往的IN-DNA模型构建过程中,涉及到IN二聚体､四聚体以及病毒DNA的模建,模建误差对后续计算结果准确性会造成一定的影响｡总之,无论单独的全长IN还是与病毒DNA的复合物结构都缺失,尽管HIV整合酶抑制剂Raltegravir已经用于临床,但是其作用机制仍未知｡Steiniger等[33]解析出Tn5转座酶与DNA末端形成的复合物结构(pdb代码:1MUS),首次提供了转座/整合路径分析的三维结构｡细菌Tn5转座酶和HIV-1 IN同属于聚核苷酸转移酶家族,催化机制类似｡Tn5转座酶常用于DNA转移研究的模型系统,和HIV-1 IN一样内含3个保守的氨基酸残基(Asp97､Asp188､Glu326,即DDE基序),与金属Mn2+稳定结合,共同对酶的DNA转移活性起关键性的作用｡Tn5-DNA复合物结构中的Mn2+被Asp97､Glu326和DNA的3′-OH所定位,共同构成的活性口袋在三维结构上与HIV-1 IN非常相似｡与HIV-1IN一样,Tn5转座酶的活性口袋区中含多个Lys残基,参与结合DNA末端序列｡另外,Tn5活性口袋区中的两个金属离子得到解析,支持双金属参与IN催化的观点｡在HIV-1 IN-DNA复合物结构缺乏的情况下,该结构是一个很好开展DNA转移机制研究的平台[34]｡图3(A)给出了Tn5转座酶的三维结构,两个Mn2+和DDE基序残基分别用黑色CPK和粉红色Stick表示,蛋白质和DNA部分则分别用绿色Solid ribbon和黄色Stick表示｡最近,Hare等[35]用X-ray方法解析出全长的原核泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)IN与病毒DNA的复合体三维结构(pdb代码:3OYA)｡晶体结构由PFV IN四聚体和两条病毒DNA组成,其中PFV IN与HIV-1 IN高度同源,均属于聚核苷酸转移酶家族｡PFV IN保留了HIV-1 IN中高度保守的DDE活性口袋区以及双金属催化中心｡Tang等[36]的对接试验表明,一系列HIV-1 IN抑制剂在PFV IN中的结合位置和在HIV-1中的结合位置相同,均是在DDE活性口袋区｡鉴于晶体库中PFV IN含HIV-1 IN没有但又十分重要的一些结构信息,比如酶多聚化和病毒DNA的结合位置等,所以PFV IN可以作为基于结构的抗AIDS药物研发的一个有效靶点｡4结语从原子水平上研究HIV-1 IN催化位点的结构信息和作用机理,进而为基于结构的IN抑制剂设计具有重要的意义｡本文把握国内外当前对IN结构研究的前沿,总结了该领域一系列代表性成果,希望借此引起读者的关注｡参考文献:[1] PERRYMAN A L, FORLI S, MORRIS G M, et al. 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艾滋病病复制过程中的关键酶的结构与功能解析艾滋病病毒复制过程中的关键酶的结构与功能解析艾滋病是一种严重的传染病，由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起。

HIV感染后，病毒会不断复制并攻击人体免疫系统，导致免疫系统功能下降，从而引发多种疾病。

在HIV的复制过程中，一些关键酶起着至关重要的作用。

本文将详细探讨艾滋病病毒复制过程中的关键酶的结构与功能。

艾滋病病毒主要通过逆转录过程进行复制，逆转录过程中的关键酶包括逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）、整合酶（Integrase, IN）和蛋白酶（Protease, PR）。

这些酶在病毒复制的不同阶段发挥着重要作用，具体如下：1. 逆转录酶（RT）：逆转录酶是艾滋病病毒复制过程中至关重要的酶之一。

逆转录酶能够将病毒RNA转录成DNA，并具有DNA依赖性DNA聚合酶和RNaseH活性。

这使得病毒的遗传物质得以转录到宿主细胞DNA中。

逆转录酶由两个亚基组成，分别是RT p66和RT p51。

RT在病毒复制过程中扮演着“重要复制工具”的角色，因此成为抗艾滋病药物研发的重要靶标。

2. 整合酶（IN）：整合酶是艾滋病病毒在感染宿主细胞后将病毒基因组整合到宿主细胞DNA中的关键酶。

整合酶能够切割病毒基因组中的两端无保护的DNA序列，并将其整合到宿主细胞基因组中。

整合酶在病毒复制过程中至关重要，因此也成为研究的重点之一。

3. 蛋白酶（PR）：蛋白酶在艾滋病病毒成熟过程中发挥着重要作用。

蛋白酶能够切割病毒多聚蛋白前体，使其转变为成熟的功能性蛋白质，从而促使病毒颗粒的组装和释放。

蛋白酶抑制剂是目前广泛用于抗艾滋病治疗的药物之一。

综上所述，逆转录酶、整合酶和蛋白酶是艾滋病病毒复制过程中的关键酶，它们共同作用于不同的复制阶段，确保病毒的复制和传播。

对这些酶的结构和功能进行深入解析，有助于揭示病毒复制的机制，为研究和开发抗艾滋病疗法提供理论依据和新的思路。

希望未来能够通过对这些关键酶的进一步研究，找到更有效的抗艾滋病药物，为预防和治疗艾滋病做出更大的贡献。

《药物设计》考查题及参考答案2015年《药物设计》考查题及参考答案⼀、名词解释1.⾻架跃迁设计从已知的活性分⼦结构出发，通过传统的类似物设计⽅法或计算化学⽅法，对先导化合物进⾏⾻架设计，以发现全新的拓扑结构⾻架和活性分⼦。

2.多靶点药物设计策略通过综合分析，合理设计出选选择性的配体结构特征，并能同时作⽤于多靶点的药物。

多靶点药物治疗，简⽽⾔之，可以同时作⽤于疾病⽹络中的多个靶点，对各靶点的作⽤可以产⽣协同效应，使总效应⼤于单个效应之和。

多靶点药物治疗可以克服许多单靶点药物的局限性，同时调节疾病⽹络系统中的多个环节，不易产⽣抗药性，达到最佳的治疗效果。

3.空间最⼤占有药物设计策略在药物分⼦设计中，往往以体积较⼤的基团代替体积较⼩的基团，其活性可能增加。

如，在4-取代的芳基四唑⼄酰苯胺类NNRTIs中，当⽤体积较⼤的环丙基或叔丁基取代甲基时，其对RT K103N/Y181C的抑制活性有显著提⾼。

基团体积增加，化合物柔性变⼩，增加了化合物对靶点的选择性，这是活性增加的前提。

4.拼合原理:将两种药物的结构拼合在⼀个分⼦内，或将两者的药效基团兼容在⼀个分⼦中，使形成的药物或兼具两者的性质，强化药理作⽤，减少各⾃相应的毒副作⽤；或使两者取长补短，发挥各⾃的药理活性，协同地完成治疗过程。

5.基于核酸代谢机理的药物设计在核酸的代谢合成与代谢分解过程中，有许多酶参与其中，这些酶尤其是某些特异性的酶就成为药物设计的理想靶点；同时模拟核酸代谢过程中的底物结构，也是药物设计的⼀条重要途径。

核苷或核苷酸是病毒复制过程中所必需摄取的物质，通过对核苷结构的改造，可以实现对病毒复制过程的⼲扰。

6. 核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI）NRTIs通过阻断病毒RNA的逆转录，即阻⽌病毒双链DNA形成，使病毒失去复制的模板⽽起作⽤。

它们⾸先进⼊被感染细胞，然后磷酸化，形成具有活性的三磷酸化合物。

这些三磷酸化合物是HIV逆转录酶的竞争抑制剂，当插⼊⽣长的DNA链时，可导致病毒DNA合成受阻，从⽽抑制病毒复制。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。