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重组细胞因子的纯化

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层析介质应用
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重组细胞因子的纯化

简介
重组细胞因子是利用基因工程技术生产的细胞因子的产品，
作为药物用于治疗肿瘤、感染、造血障碍等，可收到良好
的疗效。通过基因工程技术和多种层析分离技术表达纯化
的高纯度活性细胞因子可以有效促进免疫细胞、干细胞的
体外生长，用于细胞治疗等相关研究领域。多种相关新药
已经上市。

近年出现的动物细胞表达的细胞因子具有完整的糖基化等
翻译后修饰，避免蛋白复性，稳定的天然构象使因子比活
和长期稳定性有显著改进，逐渐成为技术发展趋势。新型
Capto系列层析填料，为来自不同表达系统的多种细胞因子

提供高效的生产纯化技术工具，通过对于宿主杂蛋白、DNA
以及未糖基化修饰完全的变体和异构体的有效去除，成功
得到多种性质均一的活性细胞因子，提高比活性。

常见的重组细胞因子有：干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤
坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、集落刺激因子
（colony-stimulating factor
）、趋化因子（chemokine）、
生长因子（growth factor, GF）、白细胞介素系列（interleukin,
IL)等。

一、原核表达细胞因子的纯化工艺
1、重组人干扰素α2b(rh-IFNα2b)的纯化：

图1：
细胞因子的功能。

2、肿瘤坏死因子(TNF)纯化工艺：
3、重组人集落刺激因子(rhG-CSF)纯化工艺：
图2：
干扰素纯化流程图及电泳检测图谱，纯度可达95%以上,比活达到

1.2×10
8
IU/m以上)。

图3：
TNF的纯化流程图。

图4：
rhGCSF的纯化流程图及电泳检测图谱，纯度>98%。

Sephacry s-l100
rh-IFNα2b

DEAE Sepharose FF
包涵体变性复性
大肠杆菌发酵

Sephacryl s-200
TNF 98%纯度

DEAE-SepharoseFF
变性取上清液
大肠杆菌包涵体表达

Sephadex G-25脱盐
Rh G-CSF

phenyl HP
包涵体变性复性
大肠杆菌发酵
Sephacryls 200图谱：Peak1洗脱峰为目的峰。
GE生命科学部填料应用部
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图5：
趋化因子的纯化流程图及色谱图。

图8：
趋化因子的纯化流程图及色谱图。

Superdex分子筛结果显示，HEK293细胞来源TNFa可保持
天然的三聚体结构 (表观分子量54kD)，具有更好的比活和
稳定性。

2、重组血管内皮生长因子(VEGF165)纯化工艺：

使用新型多模式Capto MMC阳离子交换层析，S洗脱峰可
以高盐直接进样，免去样品进样前的脱盐或稀释步骤，有
利于层析步骤间的衔接。Capto MMC温和的洗脱方式有利
于保护蛋白活性，最终得到高纯度VEGF165，和较低等昆
虫细胞表达VEGF165相比具有正确均一的糖基化，因而具
有更高的比活。

4、趋化因子(chemokine)纯化工艺：
超滤浓缩
SephacrylS-200。
趋化因子

Ni Sepharose FF
菌体破碎收集上清
大肠杆菌发酵

Ni亲和层析图谱：500mmol/L imidazole洗脱

1、分子量Marker
2、293细胞培养
上清
3、Capto DEAE
eluent
4、Capto phenyl
eluent

1、分子量Marker
2、293细胞培养
上清
3、Capto DEAE
eluent
4、Capto phenyl
eluent

图9：
HEK293表达VEGF165纯化流程图。

图10：
Capto MMC精纯VEGF165层析图谱。

Capto MMC多模式阳离子交换
VEGF165

CaptoS 阳离子交换
离心过滤澄清
HEK293细胞化学界定无血请培养
二、动物细胞表达细胞因子纯化工艺
相比细菌原核表达的细胞因子而言，哺乳动物细胞，如
HEK293人细胞表达过程中避免了包涵体形成和复性，天

然的正确折叠构象和翻译后修饰有利于提高比活性。GE
Healthcare可以提供多种层析分离技术，用于高纯度细胞因

子的纯化、生产和分析。
1、重组人肿瘤坏死因子(TNFa)纯化工艺：

图6：
HEK293表达TNFa纯化流程图。

图7：
Capto phenyl 精纯层析图谱 (红色部分为活性组分)。

Capto phenyl疏水层析
TNF 98%纯度

Capto DEAE阴离子交换
离心过滤澄清
HEK293细胞化学界定无血请培养

Capto系列疏水层析填料提高载量的同时，通过改进传质效
果进一步减小洗脱峰宽度，因而具有更好的分辨率和收率。

Left: TNFa from HEK293(ActiveMax*)：Active trimmer
Right: Refolded TNFa from E Coli：Monomer
层析介质应用

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和细菌表达相比，HEK293细胞表达IL-4 (左图) 因糖基化修
饰具有较大分子量(左图, 20kDa)，比活性相应提高5倍(Data
not shown)。

Special thanks:
以上HEK293细胞表达细胞因子工艺相关数据由
ACROBiosystems USA 友情提供。ActiveMax*无动物源性成

分活性细胞因子为ACROBiosystems公司商标。

三、订货信息
产品数量货号
Hiprep 16/60 Sephacryl S-100 HR 1 17-1165-01
Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR 117-1166-01
DEAE Sepharose FF (25ml) 117-0709-10
Q Sepharose HP (75ml) 117-1014-01
Phenyl Sepharose 6 FF (HS) 117-0973-10
Phenyl SepharoseHP (75ml) 117-1082-01
Sephadex G-25 Fine(100g) 117-0032-01
Sephadex G-50 Superfine (100g) 117-0041-01
Ni SepharoseHP(25ml) 117-5268-01
HiTrapCapto Q
5×1 ml 11-0013-02

HiTrapCapto S 5×1 ml 17-5441-22
HiTrapCapto DEAE 5×1 ml 28-9165-37
Capto Q1 25 ml 17-5316-10
Capto S1 25 ml 17-5441-10
Capto DEAE1 25 ml17-5443-10
HiTrap Desalting 5×5 ml 17-1408-01
Capto MMC 25 ml 17-5317-10
HiTrapCapto MMC 5×1ml 11-0032-73
Capto Phenyl (high sub) 25 mL 17-5451-01
HiTrap* Capto Phenyl (high sub) 5×1 mL 17-5451-08
Superdex75 10/30GL 1 17-5174-01
NHS activated 4FF 25ml
1
17-0906-01

四、参考文献
1. 重组人干扰素α 2b的提取和纯化
2. 重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究
3. 肿瘤坏死因子的分离纯化
4. 趋化因子受体CXCR4b在大肠杆菌中的高效表达、增溶及纯化
5. 两步连续离子交换制备色谱分离纯化聚乙二醇化重组人粒细
胞集落刺激因子
6. 重组人白介素18的发酵、纯化及功能鉴定技术
7. ActiveMax®: Best Cytokines Expressed in Human Cells,
http://
www.acrobiosystems.com/A161-ActiveMax%C2%AE-Best-
Cytokines-Expressed-in-Human-Cells.html#

图11：
不同细胞宿主表达VEGF165的活性比较。

图12：
HEK293表达IL-4纯化流程图。

图13：
受体亲和层析纯化IL-4层析图谱。

图14：
不同宿主细胞表达IL-4的比较。

3、重组人白介素-4纯化工艺：
IL-4>98%纯度
IL-4受体亲和层析
离心过滤澄清
HEK293细胞化学界定无血请培养

使用NHS预活化填料偶联制备IL-4 receptor受体亲和层析
填料，用于HEK293细胞表达IL-4的特异亲和纯化，可以一
步达到98%以上的纯度。

Left: IL-4 from HEK293(ActiveMax*)：20kDa Right: IL-4 from E Coli：15kDa

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重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略

重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略

重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。

二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。

一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。

以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。

如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。

重组蛋白质表达和纯化的新策略

重组蛋白质表达和纯化的新策略

重组蛋白质表达和纯化的新策略一、引言在生物医学研究和工业生产中，蛋白质的表达和纯化是非常重要的步骤。

传统的蛋白质表达和纯化方法存在许多问题，例如低表达水平、纯化困难、失活等。

为了突破这些限制，科学家们不断探索新的策略和技术。

本文将介绍一些新的重组蛋白质表达和纯化策略，以期提高表达水平和纯化效率。

二、全细胞重组表达系统为了提高蛋白质的表达水平，许多研究人员采用了全细胞重组表达系统。

这种系统将目标蛋白的基因导入宿主细胞中，并利用宿主细胞的生物合成机制进行表达。

与传统的胞外表达系统相比，全细胞重组表达系统具有优势，例如高表达水平、一次性纯化等。

其中，大肠杆菌是最常用的宿主细胞之一。

此外，酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞也被广泛应用于全细胞重组表达系统中。

三、亲和纯化技术亲和纯化技术是纯化重组蛋白质的关键步骤之一。

常见的亲和纯化技术包括金属螯合层析、抗体亲和层析和亲和标签纯化等。

金属螯合层析是利用金属离子与亲和标签结合，实现目标蛋白的纯化。

抗体亲和层析则是利用抗体与目标蛋白结合，通过柱子进行分离纯化。

亲和标签纯化是在目标蛋白的C或N端添加亲和标签，利用标签与亲和介质结合，从而实现纯化。

这些亲和纯化技术在重组蛋白质表达和纯化中发挥了重要作用，提高了纯化效率和纯度。

四、纳米技术在蛋白质纯化中的应用纳米技术是当前研究的热点之一，其在蛋白质纯化中的应用也受到了广泛关注。

例如，纳米颗粒可以作为纯化材料的载体，具有较大的比表面积，从而提高了纯化效率。

此外，纳米技术还可以用于改善蛋白质的稳定性和抗失活能力。

例如，通过纳米包裹技术，可以使蛋白质受到保护，从而提高其稳定性和生物活性。

五、衍生技术的应用除了上述策略和技术外，还有一些衍生技术被应用于重组蛋白质表达和纯化中。

例如，基因工程技术可以通过修改目标蛋白质的氨基酸序列，提高其表达水平和稳定性。

此外，蛋白质工程技术可以通过改变蛋白质的结构和功能，进一步提高纯化效率和生物活性。

重组蛋白分离纯化的基本流程

重组蛋白分离纯化的基本流程

重组蛋白分离纯化的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!重组蛋白分离纯化是生物技术领域中的一项重要技术，主要用于获取高纯度的目标蛋白以进行结构分析、功能研究以及药物开发等。

细胞因子药物分析

细胞因子药物分析


电荷等
分子大小、离子交换
分析所需时间 10～120min
分辨力
好
几小时 好
10～30min 好
样品体积 灵敏度范围 定量准确性
10～50ul ng ～ug
+
1～50ul ng～ug
±
1～50nl pg +
分析方式
紫外、荧光、折射 紫外（可见、荧光） 同HPLC
仪器价格
电化学、放射性 中～高
银染、放射自显影
分子排阻HPLC
分子大小
质谱测量法
分子大小
四、蛋白质含量测定
一般采用蛋白质的含量测定。在产品以效价表示时，不 必另测含量。
有时还要证明所得量值直接与生物测定值相关。 如已证实相关性，在生产过程中可测定含量而不测定生
物活性。
可根据物理化学性质采用Folin-酚试剂法（Lowry法 ）、染色法（Bradford法）、双缩脲法、紫外吸收法 、HPLC法和凯氏定氮等方法。
1、概念： 采用DNA重组技术或其他新生物技 术生产的治疗和预防药物。
2、分类 ｛ 重组DNA药物 重组蛋白质药物
1、重组蛋白质或重组多肽药物包括： 细胞因子类：rIFN、IL-2、EPO等；
抗细胞素治疗：CD4可溶性受体等； 重组溶血栓类：rSK、rSAK等； 人源化单克隆抗体制剂； 重组疫苗和菌苗制剂。
（2）HPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽 量采用与SDS-PAGE原理不同的反相或离子交换层析， 不主张用分子筛分析。 （3）毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高； 价格高、重现性差。
几种检定重组蛋白纯度方法的比较
特性 分离机制
HPLC
SDS-PAGE、IEF CE