实验一酵母细胞的固定化

海藻酸钠固定酵母细胞实验资料

1实验原理

海藻酸钠是应用最广泛的水溶性海藻酸盐。海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶。利用这种性质，将海藻酸钠溶液滴入含有钙离子的水溶液中可产生海藻酸钙胶球。本实验便是将酵母细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2+从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使海藻酸钠转变为不溶于水的海藻酸钙凝胶，由此将酵母细胞包埋在其中。

2实验操作过程中的几个注意点

2．1控制好配制海藻酸钠溶液的火候、浓度，实验成败的关键步骤配置海藻酸钠溶液。加热使海藻酸钠溶化是操作中重要的一环，涉及到实验的成败。教材提示是要用小火或者间断加热，反复几次，直到完全熔化。在实验操作中，教师要提醒学生按照教材的提示进行，不然会发生焦糊现象。笔者多次实际操作发现酒精灯上隔石棉网加热，匀速搅拌基本不会发生焦糊现象，而且需要时间略长，为节省时间可选用电炉加热，加快熔化，但一定要间断加热，可以用试管夹移动烧杯。完全熔化的海藻酸钠成半透明状，最好要无颗粒无气泡，类似于平常家庭中冲调好食用的藕粉。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响后续实验效果。教材提示是0.7 g海藻酸钠，加入10 mL蒸馏水，边加热边搅拌，直至完全熔化，用蒸馏水定容至10 mL。实际操作中，很多学生忘记定容，也有教师认为不需要定容。其实在加热搅拌的过程中，蒸馏水会蒸发，加热时间越长失去的蒸馏水越多,所以加热熔化结束后一定要定容，不然浓度肯定偏大，影响后续步骤中凝胶珠的形状。

2.2控制海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时的温度，保证酵母细胞的活性海藻酸钠溶液与酵母

细胞混合，一定要将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至40℃以下，通常让学生自己用手感觉烧杯壁，感觉不到烫手就差不多。再加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀。如果不等海藻酸钠溶液冷却就混合酵母细胞，大多数酵母细胞会被烫死，这样制作的凝胶珠用来发酵，葡萄糖发酵液几乎无酒味。

生物学教学２０１０年（第３５卷）第６期　用固定化酵母细胞改进“ｐＨ对酶的活性影响＂实验　黄元国　（江苏省泗洪中学２２３９０ｏ）　・４１・　

摘要“ｐＨ对酶的活性影响”实验中，由于ｐＨ为９时，碱能促进过氧化氢的分解，从而影响了实验的结果。本文介绍了使用不　同ｐＨ的固定化酵母细胞促进同一中性过氧化氢溶液分解，以及使用数码相机对实验过程进行拍摄的方法对该实验进行的改进。　改进后的方法可以使实验。得到更真实、可靠的数据。　关键词　固定化酵母细胞酶活性ｐＨ影响　１　引言　、　影响酶的活性因素有很多，主要包括ｐＨ．温度和酶　抑制剂，以及金属离子等。在苏教版教材高中《生物》　（必修１）第四章第一节“ＡＴＰ和酶”的“课题研究”中，设　计了“ｐＨ对酶的活．Ｉ生影响”实验，其技术路线为通过观　察和记录ｐＨ分别为５、７、９的过氧化氢溶液中的滤纸片　下沉后再上浮所需时间来衡量不同ｐＨ对酵母菌液中过　氧化氢酶的活性影响。此实验设计具一定的小品性和　趣味性，所用材料不多，技术也不太复杂，但在实施的过　程中，实验结果与实验预期有差距。过氧化氢酶的ｐＨ　值范围４－９，最适ｐＨ为７，在ｐＩ－Ｉ７情况下，滤纸片从进　入烧杯中过氧化氢液面到再浮出液面的时间应该最短，　但结果却是ｐＨ９的烧杯中滤纸片从进入烧杯液面到再　浮出液面的时间最短，其次才是ｐ｝ｆ７的烧杯，最慢的是　ｐＨ５的烧杯。此结果产生的原因是在酸性条件下，双氧　水的性质十分稳定，发生分解的速度较慢，此时过氧化　氢只有过氧化氢酶催化才能分解；而在碱性条件下，过　氧化氢很不稳定，分解速度很快，产生的气泡附着在试　纸上，使滤纸片的上浮时间变短。因此，探索ｐＨ对过氧　化氢酶的活性影响需避免碱性介质对过氧化氢分解的　影响。笔者选择ｐＨ分别为５、７、９的固定化酵母细胞来　催化同一中性过氧化氢溶液的分解，探索ｐＨ对酶的活　性影响，取得良好的效果。　２药品与器材　活性干酵母（市购）、ＣａＣＩ２、海藻酸钠、蒸馏水、ｌ％　的过氧化氢溶液、滤纸、ｐＨ试纸（或ｐＨ计）、石蕊试　剂、稀盐酸、ＮａＯＨ、５０ｍＬ烧杯、２００ｍＬ烧杯、５００ｍＬ烧　杯、１０００ｍＬ烧杯、注射器、玻棒、酒精灯、三角架、石棉　网、温度计、天平、数码相机等。　３方法与步骤　３．１制备ｐＨ分别为５、７、９的固定化酵母细胞凝胶珠　制备ｐＨ分别为５、７、９的固定化酵母细胞是本改进　试验的关键，方法采用人教版高中《生物》（选修１）课　题３“酵母细胞的固定化”技术中的配方和操作方法，　所用药品的使用量放大到教材中的３倍，相关烧杯也　适当增大型号。　３．１．１制备活化酵母称取干酵母３ｇ，放人２００ｍＬ　的烧杯中，加入蒸馏水３０ｍＬ，搅拌均匀，放置１ｈ，使其　活化，待用。　３．１．２制备ＣａＣ１２溶液配制０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣ１２溶　液４５０ｍＬ，等分至３只２００ｍＬ烧杯中，待用。　３．１．３配制海藻酸钠溶液称取２．１ｇ海藻钠酸钠，　放入１００ｍＬ烧杯中，加入３０ｍＬ蒸馏水，小火加热，边　加热边搅拌，至海藻酸钠呈均匀糊状，冷却至室温。　３．１．４　海藻酸钠与酵母茵混合将冷却好的海藻酸　钠溶液与已活化的酵母混合，并充分搅拌均匀，混合物　不宜过稠，以玻棒蘸取时不挂淋为度，若过稠应加少量　蒸馏水，适当稀释。　３．１．５调节海藻酸钠与酵母茵混合物ｐＨ将制备好　的海藻酸钠与酵母菌混合物分成三等份，分别置于　５０ｍＬ小烧杯中，在其中一只烧杯内滴加稀盐酸，边搅　拌边用玻棒蘸取少许，用ｐＨ试纸检测（用ｐＨ计测试　更方便），至ｐＨ为５时停止加入盐酸，加入６滴石蕊试　剂，混合物呈红色。同理向另一只烧杯内混合物中滴　加ＮａＯＨ溶液，至ｐＨ为９时停止滴加ＮａＯＨ溶液，加　入６滴石蕊试剂，混合物呈蓝色。第三只烧杯内混合　物不作处理，测试ｐＨ为７。　３．１．６制备固定化酵母细胞凝胶珠用３支注射器　分别吸取ｐＨ为５、７、９的海藻酸钠与酵母细胞的混合　物，分别缓慢滴人３只盛有０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣ１２溶液烧　杯中，滴加时要调整好注射器高度，以形成的凝胶珠圆　滑，无“小尾”出现为宜。制成的凝胶珠由于ｐＨ不同，　颜色分别为红色、白色和蓝色。　３．２过氧化氢溶液的制作将新购的３％的过氧化　氢溶液用蒸馏水配制成１％的体积分数，量取８００ｍＬ　置于１０００ｍＬ大烧杯中，待用。　３．３不同ｐＨ的固定化酵母催化过氧化氢溶液分解　选取大小相近的ｐＨ分别为５、７、９的凝胶珠各４粒（直　径４ｒａｍ），分别用蒸馏水冲洗２次。将数码相机调至摄　像档，置于适当的位置，镜头对准过氧化氢溶液的烧杯　侧面，对焦后按下快门。把ｐＨ为５的４粒凝胶珠同时　放入过氧化氢溶液中，至凝胶珠全都上浮至液面后，结　束摄像并保存文件。取出实验后的凝胶珠，再将ｐＨ为　

专题4酶的研究及应用

课题3 酵母细胞的固定化

一、教学目标

（一）知识与技能

1、识记固定化技术的常用方法

2、理解固定化酵母细胞的制备过程

3、知道固定化酶的实例

（二）过程与方法

1、固定化细胞技术

2、制备固定化酵母细胞的过程

（三）情感、态度与价值观

通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法

二、课题重点与难点

1．课题重点：制备固定化酵母细胞。

2．课题难点：制备固定化酵母细胞。

三、课题背景分析

课题背景简单介绍了从酶到固定化酶、再到固定化细胞的发展过程。这一过程体现了科学技术的发展是不断地提出问题和解决问题的动态过程。在教学中，可以参考课题背景提供的素材，联系生产实践和学生已有的认识，引导学生认同上述观点，并进而认识到：科学知识既来源于科学实验，也来源于生产生活实践，知识的学习应该与生产实践相联系；人们在生产实践中所发现的问题能够促进科学技术的发展。在生物技术实践活动中，经常涉及技术原理和实践意义等内容，实验教学中要重视这些认知成分。自1969年世界上首次成功地将氨基酰化酶固定化用于拆分氨基酶以来，固定化酶和固定化细胞技术得到迅猛地发展，已广泛应用于氨基酸的拆分和提纯、葡萄糖和果糖的生产、诊断和分析试剂的制造、消除环境污染、特定的化学反应等等。教学中，不仅应遵循人类对固定化技术的研究历程来逐步引导学生理解固定化技术的意义，而且要重视用典型实例（高果糖浆的生产）的剖析来引导学生认识固定化技术的应用价值。以下为人类对固定化技术的认识历程。

四、基础知识分析与教学

【导学诱思】

1．高果糖浆的生产需要使用 ，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的 好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。

2．使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种 上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的 。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与 接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

江苏省马坝高级中学高二生物导学案（选修1）编号04 班级 姓名 小组

1 课题4酵母细胞的固定化

【学习目标】

1. 说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。

2. 尝试制作固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

【活动方案】

活动一

课题背景

仔细阅读课题背景，想一想，我们如何能实现酶的固定化和细胞的固定化？

酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。

实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。

设想:将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

固定化酶：优点既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用__

实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成，都是通过一系例的酶促反应才能得到。

设想：能否将合成酶的细胞直接固定

固定化细胞：优点成本更低，操作更容易

活动二：固定化酶的应用实例

1. 如何利用固定化酶生产高果糖浆的？有哪些优点？

高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆，能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

2．固定化酶的方式有哪些？

活动三：固定化细胞技术

1. 给细胞固定酶和细胞固定化下个定义