UPLC-DAD法同时测定不同干燥工艺三白草中5种黄酮成分的含量

Vol. 36 No. 6Dec. 2222第36卷第6期哈尔滨商业大学学报(自然科学版)2020 年 12 月Journal of Harbin University of Commerce (Natural Sciences Edition )UPLC-MS/MS 法同时测定黄5 -甘草药对8个有效成分王晶萍2,董微微2,赫志强6,董林争2,赵丽珠2 *(2.哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨150076 ； 2.鹤岗市检验检测中心，黑龙江鹤岗154122 ； 3.谱尼测试有限公司，哈尔滨150228)摘 要：建立UPLC - M/M/方法同时测定黄C -甘草药对中毛蕊异黄酮葡萄糖P 、甘草P 、芒柄花P 、甘草素、毛蕊异黄酮、黄CUP 、芒柄花素、甘草酸8种主要成分.采用 色谱柱为Acquity BEH C 18(54 mm x2. 3 mm ,1.3 p,m )柱，流动相为乙睛-体积分数2.2%乙酸水溶液洗脱系统，流速为2. 3 mL • min -1,采用E/I 离子源，MRM 模式检测.结果显示，所测8种主要成分在测定范围内线性关系良好，相关系数均大于2.999 2；精密 度、重复性和稳定性良好；平均加样回收率为96.63% -9964% ,RSD w3.48% .首次建立可同时测定黄C -甘草药对中8种主要成分的UPLC - M/M/方法，该法操作简便，灵敏度高，专属性好，分析速度快,为解析黄C -甘草药对的临床应用提供科学依据.关键词：黄C;甘草;黄CUP;毛蕊异黄酮葡萄糖P;UPLC-MS/MS中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1672 -2946(2222)26 -2665 -26Simultanerus determination of eighi active componentu inAstragali Radix and Glycyrrhizae Radix by UPLC - MS/MSWANG Jing-ping 2, DONG Wei-wei 2, HE Zhi-qiang 6, DONG Lin-zheng 2, ZHAO Li-zhu 2*(1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 154276, China ；. Inspection and Testing Centerof Hegang , Heeang 154122 , China ；. Pony Testing International Group , Harbin 154228 , China)Abstraci ：To estatlisP a metiocl fos the simultayeoui deermindtioa of eight active compoaeei(celycosin-P -glucosine , liquiritin , oyosin , liquiritihein , celycosin , astragalosine IV , form-onoaetin , ang hycyrrbizinie acid ) in the Astragali Radix - Glycyrrhizae Radix herb pais. The eeermiatioii was pebormee cm aa Acyuity BEH C^ (54 mm x 2. 3 mm , 2.6 ^m ) , angthe mobin pPasi was compose of 2. 2% aetie atn in wateb ang acetoaitale in aranieei elu- tioa ang at 2. 3 mL • min -2 flow rate. Mas spehomeeb with electrb spray ioaizatioa (ESI) soarce was opcdan in MRM moOe. All of the dglytes showd -ooS lineebty (M2. 9992 ) inthe testee ibnges. The precisios , reneatanility ang stdaility of the were gooS for the收稿日期：2222 -22 - 26.基金项目：黑龙江省属高等学校基本科研业务费科研项目(12XN254)；国家级大学生创新创业训练计划项目(221812240214)；哈尔滨商业大学博士科研启动金项7(2219DS122);黑龙江省博士后基金(LBH-Z12166)作者简介:王晶萍(1997 -),女,研究方向：中药质量标准.通信作者:赵丽珠(1989 -),女,博士,讲师,研究方向：中药质量标准.•666•哈尔滨商业大学学报（自然科学版）第36卷eight components.The average recoveries were in the range of96.63%-99.95%with rela­tive standard deviations(RSD)W3.48%.A simple,accoratn,and sensitive methoV was es-taniisheC foe qranhtative analysis of8active compoeents in the Astragali Radix-GlycyrrhizaeRadix Oerd paid.These findings wili proviOe Oelpfai information foe the clinicoi anministra-hoa of the Astagad Radix-Glycyrrhizae Radix herd pair.Key words:Astraaad Radix；Glycyrrhizae Radix；Astragalosine IV;colycosin-7-glacosine;UPLC一MS/MS黄'为豆科植物蒙古黄'［Astraaalus tnembra-naceus（Fisco.）Bge.ver.mongholdys（E>ae.）Hsiao］或膜荚黄'［A*membranaceus（Fisch.）Bge；］的干燥根，具有补气升阳、生津养血、固表止汗、托毒生肌等功效，是我国最具代表的补气药物之一⑴.黄'配伍甘草（Glycyrraizae Radix,GR）,二者相须为用，可以大大提高二者间的协同作用⑵.黄'-甘草药对始载于《太平惠民和剂局方》，能补肺肾二气、调和脾胃表里脏腑、化津布液以滋益肾水、又能外固卫外而强曉理⑶.现代药理研究亦证明:黄'-甘草可治疗诸虚不足⑷、脾肺气虚、慢性乙型肝炎肝硬化⑷，酒精性肝纤维化及糖尿病［］等黄'中黄'甲昔、毛蕊异黄酮葡萄糖昔，甘草中甘草酸、甘草昔为主要的药理活性成分［「9］，同时上述4种成分也是药典中收录的黄'或甘草药材质量控制指标成分）黄'甲昔具有抗炎、降压、抗癌、治疗代谢性疾病等作用［1°-12］，是黄'-甘草药对中最重要的活性成分之一•毛蕊异黄酮葡萄糖昔具有抗肿瘤、抗氧化活性、抗炎作用、保护血管内皮细胞,还可通过抑制Rho/ROCK通路、上调AKT通路，改善细胞凋亡和抑制炎症，从而保护内皮细胞］.甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗氧化、抗疫调节、抗病毒、抗癌、保肝和稳定细胞膜等作用［15-1?］;甘草昔具有抗抑郁、神经保护、对肝脏毒性的保护、对心脏系统的作用［5-15］）与大量的药理活性相比，对黄'-甘草药对中主要活性成分的研究未见文献报道•丁淑芹等妙］灌胃给予昆明小鼠黄'-甘草药对水提液，发现其对环磷酰胺诱导的损伤具有保护作用，并可显著抑制增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率•此外，王迪等的黄'-甘草药对、黄'、甘草均可提高小鼠细胞免疫功能，且黄'-甘草药对组的活性强于黄'组和甘草组•另有研究发现，黄'-甘草药对可使大鼠胆汁淤积性肝硬化程度显著减轻［］）基于此,本研究采用UPLC-M//MS法同时测定黄'-甘草药对中8种主要成分含量,以期为中药黄'-甘草药对的临床应用提供科学依据.1仪器与材料1.6仪器Waters ACQUITY UPLC I-Class系统、Xeve TQS系统（美国Waters公司）;旋转蒸发仪（德国IKA公司）;AG-245电子分析天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；FW177中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；标准检验筛（66目，孔径°3°mm,绍兴上虞华丰五金仪器有限公司）；乙”和甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），乙酸（色谱纯,德国Merck公司）.1.6材料对照品毛蕊异黄酮葡萄糖昔（批号: U0520010）、甘草昔（批号：1240001°）、芒柄花昔（批号:G2299012）、甘草素（批号:T4890010）、毛蕊异黄酮（批号：34412012）、黄'甲昔（批号: T0922022）、芒柄花素（批号：Q4122012）、甘草酸（批号:3462）购于上海安谱有限公司.所有化合物经HPLC-DAD分析，纯度均大于98%.黄'购于内蒙古、贵州、河南、西、甘肃、黑龙江•甘草购于新疆、内蒙古、甘肃、西、陕西、黑龙江•样品标本保留在哈尔滨商业大学药学院中心实验室•经哈尔滨商业大学大学曲中原教授鉴定分别为豆科植物蒙古黄'Astragalas membranacees（Fisco.）Bge. vea.monga（/pas（Bge.）Hsiao的干燥根、豆科甘草属植物甘草Glycychizd araleesis Fisco.的干燥根及第6期王晶萍,等:UPLC-MS/MS法同时测定黄'-甘草药对8个有效成分-666-根茎.2方法与结果2.3色谱及质谱条件色谱采用Waters ACQUIVY™UPLC系统检测.色谱柱:Acquity UPLC BEH C15(52mm x2.3mm, 2-9p n)柱；柱温26°C；流动相:体积分数2. 2%乙酸水溶液(A)-乙”(B),梯度洗脱；洗脱程序：0~2.9min22%B,2.9~6.9min22%~66%B,6.9~9.2min66%~99%B,9.9~9.2min99% ~22%B,9.1~12.9min22%B；流速：0.3mL-mm-1；自动进样;样品室温度：22C；进样量：2pL.质谱条件：电喷雾离子源(ESI源)，多反应监测模式(MRM)检测,源温度和脱溶剂气温度分别为254C和502C,脱溶剂气为氮气,流速为2002 L-h-1,碰撞气为氮气,毛细管电压为3.9kV.8个分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压等信息见表2-表18种分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压和碰撞能量化合物保留时间/min母离子/(m•a"1)子离子/(m•a_1)锥孔电压/V碰撞能量/eV电离方式毛蕊异黄酮葡萄糖X 2.99446.2285.9*/276.92022/44ES)+甘草X 2.33426.3255.2*/135.95222/28ESI-芒柄花X 3.56432.9269.2*/291.32022/16ESI+甘草素 4.22255.3119.2*/135.22522/22ES-毛蕊异黄酮 4.35285.9415.2*/272.92033/28ES+黄_'X 5.42826.3626.2*/223.26246/55ES+芒柄花素 5.36266.9252.9*/243.41224/35ES-甘草酸 6.22542.4352.2*/113.22055/66ES-注：*定量离子2.9供试品溶液的制备黄'、甘草药材干燥24h,打粉,过62目筛,按6：1比例分别称取干燥的黄'、甘草粉末共计12--置542mL圆底烧瓶中,加水202mL,浸泡12h后，加热回流提取2h,提取3次,3542r/min离心12 min,吸取上清液,合并上清液并旋干.精密称取黄'-甘草提取物12mg-用适量12%甲醇-水溶解,经2.22pm滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液[22]-2.3对照品溶液的制备分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花、量42mL量中醇并稀释至刻度，摇匀•配成质量浓度分别为2-9mg•mL-的储备液，置于8C冰箱中储存.2.9方法学考察2.9.3专属性考察分别取对照品、供试品溶液,按“2.2”项色谱条件进行分析,各化合物之间无干扰,方法专属性良好.2.9.9线性关系考察精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花素、甘草酸标准系列溶液,配制成相当于毛蕊异黄酮葡萄糖昔质量浓度为2.92、2.22、0.94、2.12和2.92p •mL-1,甘草昔质量浓度为2.22、0.22、0.25、2.32和2.22p g•mL-，芒柄花昔质量浓度为4.42、4.44、4.48、4.12和2.22pg•mL-,甘草素质量浓度为4.41、4.42、4.45、4.32和2.22pg•mL-,毛蕊异黄酮质量浓度为2.22、2.24、2.28、2.12和2.22 p g•mL'1，黄'甲昔质量浓度为2.26、2.32、2.38、2.24和2.30pg•mL-1,芒柄花素质量浓度为2.22、2.22、2.25、2.32和2.22p g•mL'1,甘草酸质量浓度为2-02、2.02、5.02、12.2和22.2p g•mL-1，按色谱条件进样分析.以对照品峰面积为纵坐标(门，质量浓度(pg/mL)为横坐标(X ),绘制• 668 •哈尔滨商业大学学报(自然科学版)第36卷标准工作曲线.各指标成分在测定浓度范围内，线 信噪比(S/N) M 3确定检出限(LOD ) ,S/NM2确性关系良好，结果见表2.以特征离子对色谱峰的定定量限(LOQ ),结果见表2.表2 8种分析物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限化合物回归方程r线性范围/( [JLg • mL -2) LOD/ ( n- • mL -2) LOQ/(n •毛蕊异黄酮葡萄糖XY 二50 208. 3X + 28. 4099930.42 〜0. 400. 42. 5甘草XY 二 22 952X + 25. 40. 999 20. 42 〜0.22．2 2. 5芒柄花X Y 二 95 608X + ⑵」0. 999 20. 02 〜0. 40．32. 0甘草素Y 二 2 89X + 127. 20. 999 40. 02 〜0. 40 2.43毛蕊异黄酮Y 二 63 023X - 97-. 50. 999 30. 02 〜0. 40 2.43黄_'X Y 二 4 405. IX + 30. 40. 999 40. 06 〜0. 402．6芒柄花素Y二 45 545X + 644. 90. 999 70. 0 2 〜0. 40．32. 0甘草酸Y 二4 152 4X - 730. 40.999 52.60 〜20 . 621522.6.3精密度精密吸取同一份对照品溶液2 ^L,按“29”项色谱条件连续测定2次，结果显示:毛蕊异黄酮葡 萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄 董甲昔、芒柄花素、甘草酸RSD 在0.68% -3.62%之间,表明仪器精密度良好.2.6.6重复性以黄'-甘草药对提取物进行重复性考察，按照上述供试品制备方法，平行制备黄'-甘草样品6份，进样2，依法测定,记录峰面积，结果显示:毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、 毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花素、甘草酸RSD 分别为 0. 92%、. 83%、. 69%、2. 37%、. 32%、0.82%、2. 49% ,2.65%，表明方法重复性良好.2.6.6稳定性取黄'-甘草药对提取物供试品溶液，分别于室温下0、4、8、12、24、48 h,进样2 ^L,依法测定，记 峰面积， 结果显示:黄、昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花素、甘草酸RSD 在0.62% -2.64%之间,表明供.8e 稳定62.6.6加样回收率取批号为120662的黄' -甘草药对样品6份,每份约0-12 g,精密加入2种对照品，按照上述供试品制备方法，平行制备黄'-甘草样品6份,进样2 ^L,依法测定,结果显示:毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄' 甲昔、芒柄花素、甘草酸平均加样回收率分别为99. 62%、98. 62%、98. 12%、97. 23%、96. 63%、98.60%、98.44%、98.15%.2.5样品测定精密称取黄'-甘草药对，按“2. 2”项下方法 制备样品溶液，每个样本平行3份，按“2. 2项下色条件进行测定，色谱图见图22.6结果6批黄'-甘草药对药材，按“2. 2”项下方法制备样品溶液，精密吸取2咲进样UPLC - MS/MS 进行分析,测定结果见表3.表3黄5 -甘草药对中含8种成分的量(mg - g-1)批次毛蕊异黄酮葡萄糖X甘草X芒柄花X甘草素毛蕊异黄酮黄_'X芒柄花素甘草酸1006020.642 55.122 70604 70.349 20.095 20.005 70.042 677.221000020.675 6 4.575 70.409 90.301 20.122 40.057 30.057 975.921006060.277 8 3.602 00.503 80.437 90.122 90.029 70.127 934.821006040.606 64.282 40.695 70.377 80.072 80.049 20.123 509.742006020.665 7 2.672 00.969 40.770 80.129 20.053 20.099 7104.02006060.360 36.953 80.477 40.523 80.040 70.023 80.668 093.55第6期王晶萍,等:UPLC- MS/MS 法同时测定黄' -甘草药对8个有效成分• 669 •100%°0 2.0 4.0 6.08.0 10.0r/min447.03 > 270.05100%417.1 >135.06431.03 >197.11■ L2.0(B)甘草昔(A)毛蕊异黄酮葡萄糖昔100%285.03 > 270.04255.07 > 135.068.0 10.0r/min (D)甘草素% 2.0 4.0 6.0 8.0 10.04.0 6.08.0 10.0r/min100%r/minCD 黄区罠甲昔100%4.0 6.0r/min4.0 6.0 8.0 10.0r/min (C)芒炳花昔图1黄5-甘草中8种分析物的UPLC-MS/MS 色谱图821.22 > 113.073讨论本文考察了不同流动相系统，包括乙睛-水、甲醇-水、乙睛-0.1%甲酸水溶液、乙睛-0.1% 乙酸水溶液、乙睛- 1 mmol/mL 乙酸钱水溶液、甲醇-0. 3%甲酸水溶液，结果表明，乙睛-0. 1%乙 酸水系统洗脱时，待测分析物灵敏度较高、色谱峰峰形、分离度、基线噪音均能达到较好的洗脱效果,故本实验最终采用乙睛-0. 3%乙酸水溶液作为流动相系统.3种待测组分分别以质量浓度0. 54mg/L 和2.0从!^!^的流速直接用注射泵进行优化,标准溶液通过流动相注入离子源中，在正离子或负离子模式下得到准分子离子峰,再对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使每 种组分的准分子离子产生的特征碎片离子强度达到最大;标准溶液由UPLC 进样，再对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量等进行优化•选择两对离子对，其中干扰小、信噪比大的离子对作为定量离子对•设定合适的峰驻留时间(dwell time)确保色谱峰的采样点数在1〜20点,从而得到较好 的定量重复性,优化得到的质谱参数•黄酮和皂苜类化合物是黄'-甘草药对的主 要活性成分,因皂苜类化合物无紫外吸收或有微弱的紫外吸收，故用DAD 检测器无法同时测定黄酮和皂苜类化合物.所以本文首次建立UPLC - MS/MS 法同时测定黄' -甘草药对中毛蕊异黄酮葡萄糖苜、22 2 、毛蕊异黄酮、黄'2、28种有效成分含量的方法,多指标控制黄'和甘草药材提供参考.参考文献：[1] 杨 萍，周玉平,常秀春，等•黄'甲背调控Nb2/Bach1/HO - 1信号通路抑制缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤[J ]中国中药杂志,2019, doi ： 12.19544/j. enki. ejemm. 20190312. 021.[2]LIU P , WANG G , CHEN G , et ad Huangqi decoc2on inhibits apoptosis and finbsis , bui pbmotes KupffebCell activatiop in dimethylmtro-samihe-inhucen U vcs fi-U/sis in bts [ J ], BMC Complemeei Altem Med ,2012,12(1) ：51.[3 ] DU J SUN M , LIU C , er ai. Ingmnieni of Huangqi de-mtamp biliab fiUmsis pmpmssiop by -nhiUitiopthe activatiop of transforming amwth factor-Pete sivhalingpathway] J ]. BMC Complemeei Altera Med , 2012,33•674•哈尔滨商业大学学报(自然科学版)第36卷(12)：13.[4]贾伟,谢国祥，赵爱华.黄英汤对人体代谢的影响及其在疾病防治中的辅助作用[J]J Mee Res,2417,46(8):26-30.[5]慕永平，张笑，刘平.黄英总皂昔通过抑制Notch信号通路干预胆汁性肝纤维化的进展[C]//第二十四次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编.2412,123,[6]都金星，邱冰峰，刘平，等.黄英汤组分抑制胆汁淤积性肝纤维化大鼠胆管上皮细胞增殖及转分化的效应研究[J]中华肝脏病杂志,2414,18(1):13-18.[7]时代音，王锐利，刘晓丹.黄英汤对大鼠酒精性肝纤维化的保护作用[J].陕西中医，2411,32(5)：973-922.[8]王楠，高静,岳正刚，等.黄英种子萌发对光温条件和旱盐胁迫的响应特征[J]•中国中药杂志,2419,0/：14.19544//c—i.ejemm.24190323.144.[9]陈艳琰，曹玉洁,唐于平，等.甘草调和大黄“泻下攻积”作用的量-毒-效关系研究[J].中国中药杂志，2419,0/：14.19544//endi.ejemm.24194117.443,[14]张琴,陈高峰，陆雁，等.基于均匀设计分析黄茂汤活性组分抗二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的配合作用[J].中国中西医结合杂志,2411,31(14)：1389-1393.[11]王亚丽，田曼，李江，等.HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄'中2个成分的含量[J].中南药学,2418,16(9)：1268-1971.[12]张怡，靳晓飞,周晓红，等.黄'甲昔调控自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡[J].中国药理学通报,2419,35(4)：519-561.[13]WANG Y,BA Y.Stuaies on the chemical constitaeetsof Ranix astraaan and their inhibitoiy erect on HepG2proliferation[[]■Biomeeicai Research,2215,26(3):393-398.[14]LEE I,HUANG P C,ZHANG L J,et ad Iavehiga-tion of Two Species of Haanf-gt(Aatraaalas membra-nacees and Heeysarum polyCotiys)by HPLC,ITS,Microscopic Morpeolooc and Antioxinani Activities[J].F oo/and Drus Adalysis,2412,22(3):603-914.[15]张聿梅，许旭东,胡碧煌，等.黄甘草异黄酮成分的研究[J].药学学报,1997,32(4):341-344. 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超高效液相色谱法测定忍冬叶中5种黄酮成分引言忍冬是一种常见的中药材，具有清热解毒、通利气血、抗菌抗病毒等功效。

黄酮类化合物是忍冬叶中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。

准确测定忍冬叶中的黄酮成分含量对于研究忍冬的药理活性和临床应用具有重要意义。

本文将介绍一种超高效液相色谱法（UPLC）测定忍冬叶中5种黄酮成分的方法。

实验方法1. 试验仪器和试剂(1) 仪器：采用Waters ACQUITY UPLC系统，搭载Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），检测器为PDA。

(2) 试剂：乙腈、甲醇（色谱纯），乙酸乙酯（分析纯），精制水等。

2. 样品处理取忍冬叶干燥品，粉碎并通过40目筛。

取0.5g粉末，用80%甲醇超声提取30分钟，离心收集上清液。

再次加入80%甲醇超声提取30分钟，离心并收集上清液，将上清液混合，并通过0.22μm微孔滤膜过滤。

3. 色谱条件流动相A为乙腈，流动相B为0.1%乙酸乙酯溶液。

梯度洗脱如下：0-2min，5%-10%A；2-6min，10%-20%A；6-8min，20%-30%A；8-10min，30%-40%A；10-12min，40%-60%A；12-14min，60%-70%A；14-16min，70%-100%A。

采用质谱检测器进行检测，电喷雾离子源（ESI）负离子模式，扫描范围m/z200-800，毛细管电压3.5kV，锥压30V，源温度120℃，干燥气流量12 L/min。

结果与讨论通过上述条件，在忍冬叶样品中成功分离出5种黄酮成分，分别为异黄酮、槲皮素、山奈酚、槲皮苷和异蒲黄酮。

并且对这些成分进行了定量分析，方法的线性范围、检测限、定量限、稳定性和准确度均符合实验要求。

结论本研究建立了一种超高效液相色谱法测定忍冬叶中5种黄酮成分的方法，该方法简便、快速、准确，具有很好的应用前景，为进一步研究忍冬叶的药理活性和临床应用奠定了基础。

UPLC-QAMS法同时测定连翘花中5种成分的含量Δ倪素丽1＊，董岳峰2[1.山西省药品审评中心（山西省医药与生命科学研究院），太原　030006；2.山西省药品检查中心，太原　030006]中图分类号 R917文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2023）15-1826-04DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.07摘要目的建立同时测定连翘花中芦丁、连翘酯苷A、（+）-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘苷、连翘脂素5种成分的方法。

方法采用超高效液相色谱（UPLC）法进行检测。

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）；流速为0.3 mL/min ；检测波长为275 nm（0～8 min）、330 nm（8～10.5 min）、275 nm（10.5～32 min）；柱温为25 ℃；进样量为1μL。

以芦丁为参照物，采用一测多评（QAMS）法计算各成分含量，并与外标法进行比较。

结果QAMS法所得连翘花中连翘酯苷A、（+）-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘苷、连翘脂素的含量分别为7.472～7.671、2.919～2.986、1.439～1.486、1.523～1.566mg/g，外标法测定结果为7.454～7.664、2.913～2.996、1.444～1.484、1.519～1.562 mg/g，两种方法测定结果无明显差异，相对偏差＜1.0%。

结论本研究成功建立了UPLC-QAMS法同时测定连翘花中5种成分的含量，且该方法与外标法所得结果无明显差异，可用于连翘花的质量控制。

关键词超高效液相色谱；一测多评法；连翘花；芦丁；连翘酯苷A；连翘苷；连翘脂素；（+）-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷Simultaneous determination of five components in Forsythia suspensa flower with UPLC-QAMSNI　Suli1，DONG　Yuefeng2[1. Shanxi Provincial Center for Drug Evaluation （Shanxi Academy of Medicine and Life Sciences），Taiyuan 030006，China；2. Shanxi Provincial Center for Drug Inspection，Taiyuan 030006，China]ABSTRACT OBJECTIVE To establish the methods for simultaneous determination of rutin，forsythiaside A，（+）-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside，forsythin and forsythigenin in Forsythia suspensa flower.METHODS UPLC method was adopted. The determination was performed on ACQUITY UPLC HSS T3C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution （gradient elution）at the flow rate of 0.3mL/min. The detection wavelengths were set at 275nm （0-8min），330nm （8-10.5 min），275 nm （10.5-32 min）， respectively. The column temperature was 25 ℃， and sample size was 1μL. Taking rutin as reference，the content of each component was determined by quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS）method，and then compared with external standard method.RESULTS The contents of forsythiaside A，（+）-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside，forsythin and forsythigenin by QAMS were 7.472-7.671，2.919-2.986，1.439-1.486，1.523-1.566mg/g；the results obtained by the external standard method were 7.454-7.664，2.913-2.996，1.444-1.484，1.519-1.562mg/g，respectively. There was no significant difference in the measurement results between the two methods，with a relative deviation less than 1.0%. CONCLUSIONS This study successfully establishes the UPLC-QAMS method for simultaneous determination of five components in F. suspensa flower，and the results obtained by this method are not significantly different from those obtained by the external standard method. It can be used for quality control of F. suspensa flower.KEYWORDS UPLC；quantitative analysis of multi-components by single-marker method；Forsythia suspensa flower；rutin；forsythiaside A； forsythin； forsythigenin；（+）-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside连翘花为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl的干燥花[1]，具有清热解毒、消肿止痛的功效。

HPLC-DAD法同时测定三种来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分张敏敏; 赵志国; 刘伟; 崔莉; 王岱杰; 王晓; 赵恒强【期刊名称】《《山东科学》》【年(卷),期】2019(032)006【总页数】6页(P20-25)【关键词】丹参; 多指标定量; 聚类分析; 产地差异性【作者】张敏敏; 赵志国; 刘伟; 崔莉; 王岱杰; 王晓; 赵恒强【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省分析测试中心山东省中药质量控制技术重点实验室山东济南250014【正文语种】中文【中图分类】R917丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎[1]，现代药理学研究表明，丹参具有抗血栓、抗炎、抗氧化、改善微循环等作用[2-4]，临床上广泛用于心脑血管等疾病的治疗。

丹参主要产地包括山东、河南、四川以及云南等地，其中，山东已成为当前全国最大的丹参产地和丹参制商品集散地[5]。

四川为丹参的道地产区，是临床上公认的丹参质量最佳产区。

不同来源丹参饮片质量存在参差不齐的情况，而有关这种差异情况缺乏系统的研究，严重制约着各地丹参的充分开发利用。

丹参的有效成分主要是脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类[6-8]。

目前，2015版《中国药典》对于丹参的质控要求仅限于规定隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 三种丹参酮总含量和一种丹酚酸(丹酚酸B)的含量[1]。

中药是多成分、多靶点的复杂体系，有限的指标难以全面反映中药的质量。

而且，药典中丹参酮和丹酚酸的测定需采用不同的条件进行，测定方法较为复杂繁琐。

近年来，已有学者发展了丹参酮和丹酚酸的HPLC同时测定方法[9-12]，为本研究提供了技术参考。

本研究发展了超声辅助提取-HPLC-DAD同时测定丹参饮片中6种水溶性和脂溶性化学成分(咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA)的方法，并对不同来源的丹参饮片进行对比研究，研究结果将为丹参饮片的合理利用和质量评价研究提供数据支持。

UPLC法同时测定黄芩中9种黄酮类成分的含量连中学;刘玉;柴俊雯;王亚丽;郭玫;杜弢【期刊名称】《中国中医药科技》【年(卷),期】2017(024)005【摘要】目的:建立UPLC测定黄芩药材中9种黄酮类成分含量的方法.方法:采用Waters Acquity BEHC1s色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),以甲醇(A)-乙睛(B)-0.1％甲酸水溶液(C)为流动相,流速0.3 mL·min-,检测波长为278 nm和325 nm,柱温30℃.结果:9种黄酮类化合物在12 min内达到基线分离,线性关系良好(r≥0.9991).加样回收率黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A回收率分别为101.70％、98.33％、97.25％、96.27％、96.97％、95.29％、96.84％、96.69％、97.57％(RSD≤3.0％).结论:该方法快速、简便、可为全面控制黄芩质量提供参考.【总页数】3页(P604-606)【作者】连中学;刘玉;柴俊雯;王亚丽;郭玫;杜弢【作者单位】甘肃省渭源县种子管理站·甘肃渭源748200;甘肃中医药大学药学院·甘肃兰州730000;甘肃中医药大学药学院·甘肃兰州730000;甘肃中医药大学药学院·甘肃兰州730000;甘肃省中药质量与标准研究重点实验室·甘肃兰州730000;甘肃中医药大学药学院·甘肃兰州730000;甘肃省中药质量与标准研究重点实验室·甘肃兰州730000;甘肃中医药大学药学院·甘肃兰州730000;甘肃省中药质量与标准研究重点实验室·甘肃兰州730000;甘肃中医药大学药用植物遗传育种研究所·甘肃兰州730000【正文语种】中文【相关文献】1.UPLC-PDA法同时测定灯盏细辛中飞蓬苷、绿原酸和野黄芩苷的含量 [J], 郑林;王永林;王爱民;乔希;官志忠;兰燕宇2.UPLC-ESI-MS/MS法快速测定苦碟子注射液中4种黄酮类成分的含量 [J], 尹佩华;刘颖;张加余;蔡伟;李云;卢建秋3.UPLC-MS/MS 法同时测定黄芩中8种主要指标性成分的含量 [J], 谢彤;徐建亚;沈存思;狄留庆;汪受传;单进军4.UPLC法比较黄芩不同炮制品中5种黄酮类成分 [J], 罗兰;魏劭恒;张英;吴孟华;曹晖;马志国5.UPLC-MS/MS法同时测定三叶青中13种黄酮类成分的含量 [J], 李春华;袁桂平;王诚远;何倌发;陈俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３２卷第６期２０１９年１２月出版Ｖｏｌ.３２Ｎｏ.６Ｄｅｃ.２０１９ＤＯＩ:１０.３９７６/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣４０２６.２０１９.０６.００４ʌ中药与天然活性产物ɔ收稿日期:２０１９￣０８￣１９基金项目:山东省自然科学基金(ＺＲ２０１７ＬＨ０７１ꎬＺＲ２０１７ＬＨ０６９)ꎻ现代农业产业技术体系建设专项资金(ＣＡＲＳ￣２１)ꎻ 十三五 重大专项生态种植项目(ＳＱ２０１７ＹＦＣ１７０２９５)ꎻ 十三五 重点研发计划(２０１７ＹＦＣ１７０２７０１):山东省泰山学者岗位资助项目(郭兰萍)ꎻ山东省科学院先导专项(郭兰萍)作者简介:张敏敏(１９９０ )ꎬ硕士ꎬ研究方向为中药分析与质量控制ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｍｉｎｍｉｎｆｆ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ赵恒强(１９８０ )ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ研究方向为中药分析与质量控制研究ꎮＴｅｌ:０５３１－８２６０５３１９ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｈｑｚｈａｏ２００７＠１６３.ｃｏｍＨＰＬＣ￣ＤＡＤ法同时测定三种来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分张敏敏ꎬ赵志国ꎬ刘伟ꎬ崔莉ꎬ王岱杰ꎬ王晓ꎬ赵恒强∗(齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省分析测试中心山东省中药质量控制技术重点实验室ꎬ山东济南２５００１４)摘要:测定不同来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分含量ꎬ为丹参的质量评价和合理利用提供数据支持ꎮ发展了ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ同时测定丹参中的６种水溶性和脂溶性成分的方法ꎬ利用该方法对来源于山东㊁四川和云南的丹参饮片样品进行含量测定ꎬ结合聚类分析进行不同来源丹参饮片的差异性对比ꎮ结果表明:该方法简单㊁快速ꎬ可以实现丹参中不同极性成分的同时提取㊁分析ꎻ不同来源的丹参饮片中水溶性和脂溶性成分含量均存在一定的差异ꎬ来源于四川产区的丹参饮片中各成分含量最高ꎬ来源于山东产区的丹参饮片酮类成分含量优于云南产区ꎬ采用活性成分含量结合聚类分析可以实现其来源区分ꎻ不同来源的丹参饮片中各活性成分含量存在一定的差异ꎮ研究结果为丹参饮片的质量评价和合理利用提供了方法和数据支持ꎮ关键词:丹参ꎻ多指标定量ꎻ聚类分析ꎻ产地差异性中图分类号:Ｒ９１７㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０１９)０６￣００２０￣０６开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒ￣ａｎｄｆａｔ￣ｓｏｌｕｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓｏｆｔｈｒｅｅｏｒｉｇｉｎｓｕｓｉｎｇＨＰＬＣ￣ＤＡＤＺＨＡＮＧＭｉｎ￣ｍｉｎꎬＺＨＡＯＺｈｉ￣ｇｕｏꎬＬＩＵＷｅｉꎬＣＵＩＬｉꎬＷＡＮＧＤａｉ￣ｊｉｅꎬＷＡＮＧＸｉａｏꎬＺＨＡＯＨｅｎｇ￣ｑｉａｎｇ∗(ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴＣＭＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＴｅｓｔＣｅｎｔｅｒꎬＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ)ꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＴｈｉｓｓｔｕｄｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｗａｔｅｒ￣ａｎｄｆａｔ￣ｓｏｌｕｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎｓꎬａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｄａｔａｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｒａｔｉｏｎａｌｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ.Ｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｉｘｗａｔｅｒ￣ａｎｄｆａｔ￣ｓｏｌｕｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｕｓｉｎｇＨＰＬＣ￣ＤＡＤ.ＡｍｅｔｈｏｄｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓａｍｐｌｅｓｏｆｔｈｒｅｅ１２第６期张敏敏ꎬ等:ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ法同时测定三种来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎｓ:ＳｈａｎｄｏｎｇꎬＳｉｃｈｕａｎꎬａｎｄＹｕｎｎａｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙꎬｅａｓｉｌｙꎬａｎｄｒａｐｉｄｌｙｅｘｔｒａｃｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ.Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｏｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｗａｔｅｒ￣ａｎｄｆａｔ￣ｓｏｌｕｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｔｃｈｅｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ.ＡｍｏｎｇｔｈｅｓｅꎬｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｅａｃｈｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓｆｒｏｍＳｉｃｈｕａｎｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔꎬａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｓｆｒｏｍＳｈａｎｄｏｎｇｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｆｒｏｍＹｕｎｎａｎ.Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｒｅａ.ＩｎｓｕｍｍａｒｙꎬｔｈｅｒｅａｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎｓ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｄａｔａｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｒａｔｉｏｎａｌｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＤａｎｓｈｅｎꎻｍｕｌｔｉ￣ｉｎｄｅｘｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓꎻｏｒｉｇｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ㊀㊀丹参为唇形科植物丹参ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｇｅ.的干燥根和根茎[１]ꎬ现代药理学研究表明ꎬ丹参具有抗血栓㊁抗炎㊁抗氧化㊁改善微循环等作用[２￣４]ꎬ临床上广泛用于心脑血管等疾病的治疗ꎮ丹参主要产地包括山东㊁河南㊁四川以及云南等地ꎬ其中ꎬ山东已成为当前全国最大的丹参产地和丹参制商品集散地[５]ꎮ四川为丹参的道地产区ꎬ是临床上公认的丹参质量最佳产区ꎮ不同来源丹参饮片质量存在参差不齐的情况ꎬ而有关这种差异情况缺乏系统的研究ꎬ严重制约着各地丹参的充分开发利用ꎮ丹参的有效成分主要是脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类[６￣８]ꎮ目前ꎬ２０１５版«中国药典»对于丹参的质控要求仅限于规定隐丹参酮㊁丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡＡ三种丹参酮总含量和一种丹酚酸(丹酚酸Ｂ)的含量[１]ꎮ中药是多成分㊁多靶点的复杂体系ꎬ有限的指标难以全面反映中药的质量ꎮ而且ꎬ药典中丹参酮和丹酚酸的测定需采用不同的条件进行ꎬ测定方法较为复杂繁琐ꎮ近年来ꎬ已有学者发展了丹参酮和丹酚酸的ＨＰＬＣ同时测定方法[９￣１２]ꎬ为本研究提供了技术参考ꎮ本研究发展了超声辅助提取￣ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ同时测定丹参饮片中６种水溶性和脂溶性化学成分(咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ)的方法ꎬ并对不同来源的丹参饮片进行对比研究ꎬ研究结果将为丹参饮片的合理利用和质量评价研究提供数据支持ꎮ２㊀材料与方法２.１㊀实验仪器及材料ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＵｌｔｉＭａｔｅ３０００超高效液相色谱仪(美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司)ꎬ配有二元梯度泵㊁在线脱气机㊁自动进样器㊁柱温箱㊁ＤＡＤ检测器ꎻＣＰＡ２２５Ｄ型十万分之一电子分析天平(德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司)ꎻＳＢ￣５２００Ｄ型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)ꎻＦＷ１００型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)ꎮ对照品为咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ(上海源叶生物科技有限公司ꎬ纯度均大于９８％)ꎻ甲醇㊁乙腈(美国Ｔｅｄｉａ公司ꎬ色谱纯)ꎻ乙醇(国药集团ꎬ分析纯)ꎻ甲酸(美国ＲＯＥ公司ꎬ色谱纯)ꎮ丹参样品购于济南市各药店及药材市场ꎬ经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为唇形科植物丹参ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｇｅ.的干燥根和根茎ꎮ具体样品信息见表１ꎮ表１㊀样品信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓａｍｐｌｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ编号名称产地编号名称产地１同仁堂丹参饮片１山东６建联大药房丹参饮片４山东２同仁堂丹参饮片２山东７三九药店丹参饮片１山东３建联大药房丹参饮片１山东８三九药店丹参饮片２山东４建联大药房丹参饮片２山东９聚三好丹参饮片１山东５建联大药房丹参饮片３山东１０聚三好丹参饮片２山东２２山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年续表１编号名称产地编号名称产地１１森霖堂丹参饮片１四川广元１５ＳＵＮＣＬＡＲＡ丹参饮片１云南１２森霖堂丹参饮片２四川广元１６ＳＵＮＣＬＡＲＡ丹参饮片２云南１３福曦堂丹参饮片１四川中江１７ＳＵＮＣＬＡＲＡ丹参饮片３云南１４福曦堂丹参饮片２四川中江２.２㊀实验方法２.２.１㊀供试品溶液的制备取丹参饮片粉碎ꎬ过４号筛ꎮ精密称取丹参药材粉末０.２ｇꎬ加入２０ｍＬ８０％甲醇水溶液ꎬ称重ꎬ超声恒温提取３０ｍｉｎꎬ冷却至室温称重后用８０％甲醇水溶液补足失重ꎮ提取液经０.２２μｍ滤膜抽滤后备用ꎮ２.２.２㊀对照品溶液的制备精密称取咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ对照品适量ꎬ加甲醇配制成浓度分别为１.７０㊁２.４０㊁１.００㊁１.３０㊁１.２０㊁１.００ｍｇ ｍＬ￣１的对照品储备溶液ꎬ４ħ存储备用ꎮ使用时ꎬ用甲醇稀释上述标准储备溶液ꎬ配制成不同浓度的单标溶液ꎮ各取单标溶液适量ꎬ配制所需浓度的混合标准溶液ꎮ２.２.３㊀色谱条件ＬｕｎａＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)柱ꎮ流动相Ａ为乙腈ꎬ流动相Ｂ为水(０.６％乙酸)ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ进样量１０μＬꎬ检测波长２５４ｎｍꎮ梯度洗脱:０~５ｍｉｎꎬ３％~７％Ａꎻ５~８ｍｉｎꎬ２％~２２％Ａꎻ８~１５ｍｉｎꎬ２２％~７０％Ａꎻ１５~２５ｍｉｎꎬ７０％~９０％Ａꎻ２５~３０ｍｉｎꎬ９０％~１００％Ａꎮ３㊀结果与讨论３.１㊀色谱条件优化本文考察了ＫｒｏｍｏｓｉａｌＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)㊁ＡｇｉｌｅｎｔＳＢＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)㊁ＡｇｉｌｅｎｔＴＣＣ１８(４.６ˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)和ＬｕｎａＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)色谱柱针对丹参中咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ６种成分的分离效果ꎮ结果表明ꎬ采用ＬｕｎａＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)色谱柱时ꎬ峰型和分离度较好ꎮ因此ꎬ选用ＬｕｎａＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５.０μｍ)色谱柱对丹参饮片提取物进行色谱分析ꎮ对比了相同比例的乙腈￣水和甲醇￣水体系对提取物的分离效果ꎮ结果发现ꎬ采用乙腈￣水体系时ꎬ丹参饮片提取物分离效果明显较好ꎬ故采用乙腈￣水体系作为流动相ꎮ由于丹参提取物成分复杂ꎬ等度洗脱难以实现上述６种成分的色谱分离ꎬ因此采用梯度洗脱对丹参提取物进行分析ꎮ咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ等成分属于酸性成分ꎬ易造成色谱峰拖尾ꎬ在流动相中加入一定量的弱酸可以抑制有机酸的电离从而改善色谱峰峰型ꎮ考察了水相分别加入不同比例的乙酸(０.２％㊁０.４％㊁０.６％和０.８％)对丹参提取物色谱分离的影响ꎬ结果发现水相中加入０.６％乙酸时色谱峰对称性较好㊁峰型尖锐ꎮ另外ꎬ柱温对色谱峰分离度㊁峰型和保留时间等均具有一定的影响ꎮ先后调节柱温箱温度在２５㊁３０㊁３５㊁４０和４５ħ时比较得出ꎬ当柱温为４０ħ时ꎬ色谱峰分离度和峰型明显较好ꎬ可以用于后续研究ꎮ在波长选择上ꎬ经二极管阵列检测器考察各类成分在不同波长(１９０~６００ｎｍ)下的紫外吸收波长ꎮ结果表明ꎬ在２５４ｎｍ下各类成分均有吸收ꎬ且各化合物具有较好的分离度和灵敏度ꎬ因此选择２５４ｎｍ作为检测波长ꎮ在优化后的色谱条件下ꎬ丹参提取物的色谱分离图如图１所示ꎮ第６期张敏敏ꎬ等:ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ法同时测定三种来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分１咖啡酸ꎻ２迷迭香酸ꎻ３丹酚酸Ｂꎻ４二氢丹参酮Ⅰꎻ５隐丹参酮ꎻ６丹参酮ⅡＡ图１㊀丹参８０％甲醇提取物的ＨＰＬＣ图Ｆｉｇ.１㊀ＨＰＬＣＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＤａｎｓｈｅｎ３.２㊀方法学考察３.２.１㊀线性关系考察分别精密吸取６种对照品溶液适量ꎬ按照不同比例稀释得到不同浓度的混合对照品溶液ꎮ按照３.１的色谱条件进样分析ꎬ以峰面积为纵坐标(ｙ)ꎬ化合物浓度为横坐标(ｘ)绘得各化合物标准曲线ꎬ各化合物的回归方程㊁相关系数㊁线性范围㊁检测限(３倍信噪比计算)㊁定量限(１０倍信噪比计算)见表２ꎮ由表２中可以看出ꎬ在给出的线性范围内各化合物所建立的标曲线性良好ꎬ可以用于后续的定量分析ꎮ表２㊀６种成分的回归方程㊁检测限和定量限Ｔａｂｌｅ２㊀Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎꎬｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｓｉｘｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ序号化合物回归方程相关系数线性范围/(μｇ ｍＬ￣１)检测限/(μｇ ｍＬ￣１)定量限/(μｇ ｍＬ￣１)１咖啡酸ｙ＝３９８.９４ｘ＋０.０９６２０.９９９８０.１７~８５.０００.００７３０.０２４３２迷迭香酸ｙ＝２０１.００ｘ＋０.２６４６０.９９９６０.２４~１２０.０００.０１０３０.０３４３３丹酚酸Ｂｙ＝２０３.９８ｘ＋０.０５２７１.００００５.００~１０００.０００.００４８０.０１６０４二氢丹参酮Ⅰｙ＝９５７.６６ｘ￣０.１１７８０.９９９３０.６５~６５.０００.００７２０.０２４１５隐丹参酮ｙ＝５６７.２９ｘ＋０.１５８５０.９９９６０.６０~６０.０００.００２００.００６５６丹参酮ⅡＡｙ＝１１１５.３０ｘ＋０.３６４８０.９９９８０.５０~１００.０００.００９２０.０３０８３.２.２㊀精密度实验精密称定丹参样品０.２ｇꎬ处理后按２.２.３的色谱条件连续进样６次ꎬ分别测出６种化合物的峰面积和保留时间ꎬ计算出各个化合物的峰面积和保留时间的相对标准偏差ꎮ６种化合物峰面积的相对标准偏差分别为２.２９４％㊁０.８０４％㊁１.０００％㊁２.９１４％㊁０.３２９％㊁０.０８１％ꎻ保留时间的相对标准偏差分别为０.０２０％㊁０.０２５％㊁０.０８３％㊁０.０１３％㊁０.０１５％㊁０.０１１％ꎬ说明仪器精密度良好ꎮ３.２.３㊀重复性实验精密称定同一丹参样品６份ꎬ分别用２.２.１制备供试品溶液的方法处理ꎬ精密吸取５μＬ进样分析ꎬ经过计算得到６种化合物峰面积的相对标准偏差分别为２.６９２％㊁２.４５１％㊁２.３８０％㊁１.９４４％㊁２.１３７％㊁２.９５２％ꎻ保留时间的相对标准偏差分别为０.２１０％㊁０.０２０％㊁０.０３１％㊁０.０４１％㊁０.０３４％㊁０.１７３％ꎬ说明该方法的重现性较好ꎮ３.２.４㊀稳定性实验取丹参样品分别于０㊁２㊁４㊁８㊁１２㊁２４ｈ进样分析ꎬ检测和计算得到６种化合物峰面积的相对标准偏差分别为３.３３３％㊁２.６５９％㊁２.３０５％㊁１.６２０％㊁０.９６１％㊁２.５１２％ꎻ保留时间的相对标准偏差分别为０.０２０％㊁０.０５３％㊁０.１１５％㊁０.００８％㊁０.０１２％㊁０.０１０％ꎮ由于其保留时间的相对标准偏差均小于１％ꎬ峰面积的相相对标准偏差均小于４％ꎬ说明该样的化学性质在２４ｈ内较稳定ꎮ３.２.５㊀加标回收率精密称取丹参样品６份ꎬ每份０.２ｇꎬ分别精密称定加入咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹３２山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年参酮和丹参酮ⅡＡ标准品适量ꎬ按上述供试品溶液制备方法处理后进样分析ꎮ其平均回收率(ｎ＝６)分别为９４.４２％㊁９２.３２％㊁１０１.０４％㊁９４.８２％㊁９５.３９％㊁１０４.１９％ꎬ相对标准偏差分别为２.８７％㊁１.９８％㊁３.０１％㊁２.９５％㊁３.７１％和４.１９％ꎮ结果表明ꎬ各目标成分加标回收率为９２.３２％~１０４.１９％ꎬ回收率良好ꎮ３.３㊀含量测定取１７批不同来源的丹参样品ꎬ采用２.２.１样品溶液制备方法进行制备ꎬ分别进样分析ꎬ得出上述６种化合物的相应峰面积ꎬ根据上述方法中回归方程算出各化合物的含量ꎬ平行３次取平均值ꎮ利用Ｏｒｉｇｉｎ７.５对所有含量测定数据按来源分组处理ꎬ得到带误差棒的柱状图ꎬ见图２ꎮ由图２中可以看出ꎬ来源于四川的丹参饮片中的６种成分含量均高于源自山东和云南的ꎬ尤其以丹酚酸Ｂ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ的含量较为明显ꎮ６种成分的总平均含量为(１１.７２ʃ０.７１)ｍｇ ｇ－１ꎮ图２㊀三组丹参饮片中各化合物含量柱状图Ｆｉｇ.２㊀ＨｉｓｔｏｇｒａｍｏｆｅａｃｈｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｒｅｅｏｒｇｉｎｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ不同来源丹参饮片中各化合物的含量均有差异ꎮ山东产丹参饮片的二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ３种丹参酮的含量高于云南产丹参饮片ꎬ来源于山东和云南的丹参饮片中上述３种丹参酮总含量分别为(３.５２ʃ０.１７)ｍｇ ｇ－１和(３.１４ʃ０.１７)ｍｇ ｇ－１ꎮ而源自山东的丹参饮片中咖啡酸㊁迷迭香酸和丹酚酸Ｂ的含量低于源自云南的丹参饮片ꎬ这两个地区丹参饮片中３种酚酸总含量分别为(３７.７５ʃ２.２６)ｍｇ ｇ－１和(５４.０９ʃ０.２７)ｍｇ ｇ－１ꎮ３.４㊀聚类分析聚类分析又称群分析ꎬ是研究样品或指标分类问题的一种统计分析方法ꎬ同时也是数据挖掘的一个重要算法ꎮ本研究中以１７批不同来源的丹参饮片样本为研究对象ꎬ以ＨＰＬＣ法测得的６种水溶性和脂溶性成分的含量为变量ꎬ进行聚类分析ꎬ以得到各样本间的聚集关系ꎬ见图３ꎮ图３㊀１７批丹参饮片样本的聚类分析图谱Ｆｉｇ.３㊀Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｍａｐｏｆ１７ｓａｍｐｌｅｓｏｆＤａｎｓｈｅｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｌｉｃｅｓ由聚类结果可以看出ꎬ图３中１~１０批样本为一组ꎬ１１~１４号样本为一组ꎬ１５~１７号样本为一组分别聚４２５２第６期张敏敏ꎬ等:ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ法同时测定三种来源丹参饮片中水溶性和脂溶性成分集ꎬ结合表１中样品来源信息可知这三组样本分别来源于山东㊁四川和云南ꎬ该聚集关系与样品信息高度一致ꎮ其中四川组和云南组聚集关系较近ꎬ推测可能是由于四川与云南地理来源较为接近ꎬ丹参药材的种植条件(环境㊁气候等)较为相似ꎬ造成所含化学成分具有相似的分布规律ꎮ其次ꎬ各组内部也存在聚集关系差异ꎬ１１~１４号样本组即四川组样本中ꎬ１１㊁１２号和１３㊁１４号分别聚集较近ꎬ可能是由于这两组饮片分别来源于四川不同产区ꎮ山东组中由于样本量较大且来源复杂ꎬ其内部聚集划分等级和组别较多ꎮ可以看出ꎬ采用本研究测定的丹参中６种水溶性和脂溶性成分含量结果结合聚类分析ꎬ可以较好地实现对不同来源丹参饮片样品的区分ꎬ可以较为明显地表现出各样本间的差异关系ꎮ４㊀结论本研究发展了超声辅助提取￣ＨＰＬＣ￣ＤＡＤ同时测定丹参饮片中６种成分ꎬ即咖啡酸㊁迷迭香酸㊁丹酚酸Ｂ㊁二氢丹参酮Ⅰ㊁隐丹参酮和丹参酮ⅡＡ的方法ꎮ研究表明ꎬ该方法简单㊁快速ꎬ可以实现丹参中不同极性成分的同时提取㊁分析ꎮ应用该方法对山东㊁四川和云南不同来源的丹参饮片进行分析表明ꎬ三个来源丹参饮片中各化合物的含量均存在一定差异ꎬ结合聚类分析可以实现其来源区分ꎬ进一步证明了其产地差异性ꎮ但由于受到样品数量的限制ꎬ详细的差异分析有待进一步研究ꎮ本研究为了解不同来源丹参饮片的质量现状及合理利用提供了科学依据ꎮ参考文献:[１]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版一部[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５.[２]ＰＥＮＧＷＢꎬＺＥＮＧＱＨꎬＬＩＤＰꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｎ￣ｌｉｎｅＨＰＬＣｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎＤａｎｓｈｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬ２０１６ꎬ３０(１１):１８５４￣１８６０.ＤＯＩ:１０.１００２/ｂｍｃ.３７７２. [３]ＬＵＳＡＲＣＺＹＫＳꎬＺＩＭＭＥＲＭＡＮＮＳꎬＫＡＩＳＥＲＭꎬｅｔａｌ.Ａｎｔｉｐｌａｓｍｏｄｉａｌａｎｄａｎｔｉｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ￣ｔｙｐｅｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ[Ｊ].ＰｌａｎｔａＭｅｄｉｃａꎬ２０１１ꎬ７７(１４):１５９４￣１５９６.ＤＯＩ:１０.１０５５/ｓ￣００３０￣１２７０９３３. 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多波长ＨＰＬＣ－ＤＡＤ法同时测定美白类化妆品中８种甘草化学成分吴晓云ꎬ李思龙ꎬ刁飞燕ꎬ李启艳ꎬ冉金凤ꎬ刘春霖(山东省食品药品检验研究院ꎬ国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１)摘要:目的㊀建立多波长高效液相色谱－二极管阵列检测器(ＨＰＬＣ－ＤＡＤ)法同时测定美白类化妆品中８种甘草化学成分的含量ꎮ方法㊀样品经７０％甲醇溶液提取㊁过滤后ꎬ经ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８色谱柱(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)分离ꎬ流动相为乙腈－０.１％磷酸ꎬ梯度洗脱ꎬ２３１㊁２４９和３６５ｎｍ波长同时检测ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ柱温３０ħꎮ结果㊀８种成分分离度良好ꎬ在各进样浓度范围内线性关系良好ꎬ相关系数ｒ均大于０.９９８ꎻ４种不同化妆品基质的平均加样回收率(ｎ＝３)为８８.３％~９６.２％ꎬ相对标准偏差(ＲＳＤ)为０.９％~３.５％ꎮ结论㊀本方法准确可靠㊁灵敏度高ꎬ可用于同时测定化妆品中８种甘草化学成分ꎮ关键词:化妆品ꎻ甘草ꎻ多波长ꎻ高效液相色谱法中图分类号:Ｒ９２７.２㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)０９－０６８０－００５ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.０９.００７Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ８ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅＲａｄｉｘｅｔＲｈｉｚｏｍａｉｎｗｈｉｔｅｎｉｎｇｃｏｓｍｅｔｉｃｓｂｙｍｕｌｔｉ－ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈＨＰＬＣ－ＤＡＤＷＵＸｉａｏｙｕｎꎬＬＩＳｉｌｏｎｇꎬＤＩＡＯＦｅｉｙａｎꎬＬＩＱｉｙａｎꎬＲＡＮＪｉｎｆｅｎｇꎬＬＩＵＣｈｕｎｌｉｎ(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌｏｆＣｏｓｍｅｔｉｃｓＲａｗＭａｔｅｒｉａｌꎬＳｈａｎｄｏｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｍｕｌｔｉ－ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈＨＰＬＣ－ＤＡＤｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ８ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎ￣ｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅＲａｄｉｘｅｔＲｈｉｚｏｍａｉｎｗｈｉｔｅｎｉｎｇｃｏｓｍｅｔｉｃｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ７０％ｍｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｆｉｌｔｅｒｅｄꎬｔｈｅｎｓｅｐａｒａｔｅｄｏｎａＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８ｃｏｌｕｍｎ(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ｕｓｉｎｇａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄｔｈｅａ￣ｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ０.１％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎａｎｄａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ１.０ｍＬ ｍｉｎ－１.Ｔｈｅｄｅｔｅｃ￣ｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓｗｅｒｅ２３１ꎬ２４９ａｎｄ３６５ｎｍａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０ħ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅ８ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｗｅｒｅｗｅｌｌｓｅｐａｒａｔｅｄ.Ａｌｌｏｆｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄａｌｌｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅａｂｏｖｅ０.９９８ꎻＴｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｉｎ４ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｓｗｅｒｅｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ８８.３％~９６.２％ꎬｗｉｔｈＲＳＤｏｆ０.９％~３.５％(ｎ＝３).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ.Ｉｔｃａｎｂｅｕｔｉｌｉｚｅｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａ￣ｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ８ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅＲａｄｉｘｅｔＲｈｉｚｏｍａｉｎｃｏｓｍｅｔｉｃｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣｏｓｍｅｔｉｃｓꎻＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅＲａｄｉｘｅｔＲｈｉｚｏｍａꎻＭｕｌｔｉ－ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈꎻＨＰＬＣ㊀㊀植物原料及其提取物由于安全性高㊁作用温和等独特的优势ꎬ因此在化妆品行业有良好的开发和应用前景ꎮ甘草提取物主要包括黄酮类㊁三萜类和多糖类等活性成分ꎬ具有美白㊁防晒㊁抗氧化㊁抗炎和抗菌等功效[１－４]ꎬ被广泛应用于护肤类㊁美白类㊁防晒类等多种化妆品中ꎮ目前ꎬ涉及化妆品中甘草类化学成分的检测标准有３个ꎬ国家标准«ＧＢ/Ｔ３５９５４－２０１８化妆品中１０种美白祛斑剂的测定高效液相色谱法»㊁行业标准«ＳＮ/Ｔ１５００－２００４化妆品中甘草酸二钾的检测方法液相色谱法»与团体标准«Ｔ/ＣＡＦＦＣＩ１－２０１８化妆品用原料甘草酸二钾»ꎬ且以上标准只涉及甘草酸二钾的检测ꎮ甘草提取物中除含甘草酸二钾ꎬ还含有甘草苷㊁异甘草苷㊁甘草查尔酮Ｂ㊁甘草素㊁异甘草素㊁甘草查尔酮Ａ和光甘草定等多种化学活性成分ꎬ本文建立多波长高效液相色谱－二极管阵列检测器(ＨＰＬＣ－ＤＡＤ)法可同时测㊀作者简介:吴晓云ꎬ女ꎬ副主任药师ꎬ研究方向:中药与化妆品检测㊁质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:４４１３１４１８４＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:刘春霖ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:化妆品与保健食品检测㊁质量标准研究ꎬTel:158****0988ꎬE－ｍａｉｌ:ｃｈｕｎｌｉｎ０３２０＠１２６.ｃｏｍ定以上８种甘草化学成分ꎮ文献报道甘草成分检测方法有高效液相色谱法[５－６]㊁超高效液相色谱法[７]㊁液相色谱－质谱法等[８－１０]ꎬ主要涉及中药材及其提取物研究ꎮ化妆品领域甘草化学成分的测定方法主要为高效液相色谱法[１１－１２]ꎬ文献[１３]在２３７ｎｍ波长下测定化妆品中的４种甘草成分ꎬ陆军等[１４]在２３７ｎｍ波长下测定７种甘草成分ꎮ笔者未见文献报道化妆品中甘草查尔酮Ｂ和异甘草素的测定ꎬ单一检测波长很难兼顾每个组分的最佳检测灵敏度ꎬ且同一提取方法可能不适用于多种复杂的化妆品基质ꎮ本方法在优化乳液类㊁膏霜类㊁水剂类和凝胶类４种基质前处理方法基础上ꎬ建立多波长ＨＰＬＣ－ＤＡＤ法同时测定８种甘草化学成分ꎬ该方法操作简单㊁灵敏度和准确度高ꎬ为产品质量提供保障ꎮ１㊀仪器与材料１.１㊀仪器与设备㊀ＬＣ－４０Ｄ高效液相色谱仪(日本岛津公司)ꎬ配ＤＡＤ检测器ꎻＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏＭＳ电子天平(梅特勒－托利多国际贸易上海有限公司)ꎻＵ￣ｎｉｖｅｒｓａｌ３２０Ｒ高速离心机(德国Ｈｅｔｔｉｃｈ公司)ꎻＫＱ－５００ＤＥ超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)ꎻＭｉｌｌｉ－Ｑ型超纯水仪(美国密理博公司)ꎮ１.２㊀材料与试剂㊀乙腈㊁甲醇(色谱纯ꎬ霍尼韦尔贸易上海有限公司)ꎻ磷酸(优级纯ꎬ国药集团化学试剂有限公司)ꎻ超纯水ꎮ标准品:甘草苷(批号:Ｚ１０Ｊ８Ｘ３９６１１ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎻ异甘草苷(批号:Ｙ１５Ａ１０Ｈ９５３４４ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎻ甘草查尔酮Ｂ(批号:Ｗ１０Ｓ１０Ｚ９６９５３ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎻ甘草素(批号:Ｔ４８９００１０ꎬ含量９９.０％ꎬ上海安谱实验科技股份有限公司)ꎻ甘草酸二钾(批号:Ｆ１２Ｍ６Ｚ１ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎻ异甘草素(批号:３８６４００１０ꎬ含量９９.９％ꎬ上海安谱实验科技股份有限公司)ꎻ甘草查尔酮Ａ(批号:Ｐ２１Ｏ８Ｆ４６４７３ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎻ光甘草定(批号:Ｋ２７Ａ９Ｒ５９９６０ꎬ含量９８％ꎬ上海源叶生物科技有限公司)ꎮ３０批美白类化妆品均为市售产品ꎮ２㊀方法与结果２.１㊀色谱条件㊀色谱柱:ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎻ柱温:３０ħꎻ流速:１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ进样体积:１０μＬꎮ流动相:乙腈(Ａ)－０.１％磷酸溶液(Ｂ)ꎬ梯度洗脱(０~４ｍｉｎꎬ２４％Ａꎻ４~２７ｍｉｎꎬ２４％Ａң８０％Ａꎻ２７~３０ｍｉｎꎬ８０％Ａң２４％Ａꎻ３０~３３ｍｉｎꎬ２４％Ａ)ꎮ检测波长:２３１ｎｍ(甘草苷㊁甘草素和光甘草定)㊁２４９ｎｍ(甘草酸二钾)㊁３６５ｎｍ(异甘草苷㊁甘草查尔酮Ｂ㊁异甘草素㊁甘草查尔酮Ａ)ꎮ２.２㊀标准溶液的制备㊀分别精密称取甘草苷１２.０１ｍｇ㊁异甘草苷１０.６５ｍｇ㊁甘草查尔酮Ｂ７.８５ｍｇ㊁甘草素９.５０ｍｇ㊁甘草酸二钾１２.０４ｍｇ㊁异甘草素１０.１９ｍｇ㊁甘草查尔酮Ａ１０.２９ｍｇ㊁光甘草定１０.８３ｍｇꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加甲醇溶解并定容至刻度ꎬ配成标准储备液ꎮ分别精密吸取上述标准储备液各１.０ｍＬꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加甲醇稀释并定容至刻度作为混合标准溶液ꎮ２.３㊀供试品溶液的制备２.３.１㊀乳液类和膏霜类㊀准确称取０.５ｇ样品(精确至０.０００１ｇ)于２５ｍＬ具塞比色管中ꎬ加入０.５ｍＬ饱和氯化钠水溶液ꎬ震荡混匀ꎬ再加入１０ｍＬ７０％甲醇ꎬ涡旋混匀５ｍｉｎ后ꎬ超声提取２０ｍｉｎꎬ４０００ｒ ｍｉｎ－１离心４ｍｉｎ后ꎬ取上清液于比色管中ꎬ残渣再加１０ｍＬ７０％甲醇重复上述步骤ꎬ合并两次提取液ꎬ用氮气吹干至５ｍＬ左右ꎬ再加入甲醇溶解定容至１０ｍＬꎬ－１８ħ冷冻１ｈ后ꎬ４ħ下６０００ｒ ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎꎬ取上清液经０.４５μｍ滤膜过滤ꎬ取续滤液ꎬ即得ꎮ２.３.２㊀水剂类和凝胶类㊀准确称取０.５ｇ样品(精确至０.０００１ｇ)于１０ｍＬ具塞比色管中ꎬ加入适量７０％甲醇溶液ꎬ涡旋混匀５ｍｉｎ至样品完全分散ꎬ超声提取２０ｍｉｎꎬ冷却后定容至１０ｍＬꎬ－１８ħ冷冻１ｈ后ꎬ４ħ下６０００ｒ ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎꎬ取上清液经０.４５μｍ滤膜过滤ꎬ取续滤液ꎬ即得ꎮ２.４㊀系统适用性试验㊀精密量取 ２.２ 项下混合标准溶液１.０ｍＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加甲醇溶解并定容至刻度ꎬ将上述溶液按 ２.１ 项下色谱条件进样ꎮ结果ꎬ在２３１ｎｍ波长下８种成分分离度均大于２.５ꎬ达到基线分离ꎬ理论板数均大于７０００ꎮ２.５㊀线性关系考察㊀精密量取混合标准溶液适量ꎬ用甲醇分级稀释ꎬ按照上述色谱条件分别进样ꎬ以溶液浓度(Ｘ)为横坐标ꎬ色谱峰面积(Ｙ)为纵坐标ꎬ进行线性回归ꎮ结果表明ꎬ８种成分在一定浓度范围内线性关系良好ꎬ结果见表１ꎮ２.６㊀回收率试验㊀取４种不同化妆品空白基质(水剂类㊁膏霜类㊁凝胶类和乳液类)各０.５ｇꎬ分别精密加入标准储备液适量ꎬ使添加水平分别为低㊁中和高３个水平ꎬ每个水平平行制备３份样品ꎬ按 ２.３ 项下制备供试品溶液后进样测定ꎬ得到８种成分平均加样回收率范围为８８.３％~９６.２％ꎬＲＳＤ为０.９％~３.５％ꎬ回收率良好ꎬ结果见表２ꎮ表１㊀各成分的线性范围㊁回归方程和相关系数成分线性范围/ｍｇ Ｌ－１回归方程ｒ甘草苷０.１１７７~１１.７７Ｙ＝１８.５８Ｘ－１.８８８０.９９８８异甘草苷０.１０４４~１０.４４Ｙ＝１４.１４Ｘ－１.０４５０.９９８８甘草查尔酮Ｂ０.０７６９３~７.６９３Ｙ＝１９.５８Ｘ－１.３５６０.９９８８甘草素０.０９４０５~９.４０５Ｙ＝３９.０２Ｘ－２.４３００.９９９０甘草酸二钾０.１１８０~１１.８０Ｙ＝２.９８８Ｘ－０.２７０６０.９９９９异甘草素０.１０１８~１０.１８Ｙ＝２１.２９Ｘ－１.５０６０.９９９１甘草查尔酮Ａ０.１００８~１０.０８Ｙ＝１６.７３Ｘ－１.２６５０.９９９１光甘草定０.１０６１~１０.６１Ｙ＝４３.５４Ｘ－３.１６２０.９９９１２.７㊀稳定性试验㊀取回收率试验制备的低浓度供试品溶液(水剂类㊁膏霜类㊁凝胶类和乳液类)ꎬ按上述色谱条件分别在０㊁２㊁４㊁６㊁１２㊁２４ｈ进样分析ꎬ分别记录８种成分峰面积ꎬ计算ＲＳＤ在１.１％~２.０％之间(ｎ＝２)ꎬ表明８种成分在２４ｈ内稳定性良好ꎮ２.８㊀精密度试验㊀取系统适用性试验所制备的混合标准溶液ꎬ重复进样６次ꎬ分别记录８种待测物峰面积ꎬ计算ＲＳＤ在０.７％~１.４％之间ꎬ表明仪器精密度良好ꎬ结果见表３ꎮ表２㊀８种成分的平均回收率和ＲＳＤ(ｎ＝３)成分加入量/μｇ水剂类膏霜类凝胶类乳液类回收率(％)ＲＳＤ(％)回收率(％)ＲＳＤ(％)回收率(％)ＲＳＤ(％)回收率(％)ＲＳＤ(％)２.３５４９５.０２.１９０.２２.４９４.１２.２９３.８２.７甘草苷１１.７７９４.３１.８９０.５１.７９３.６１.８９５.３２.２５８.８５９６.２１.９９２.１１.８９４.３１.３９４.５２.２２.０８８９３.８２.２９２.９２.５９３.１１.９９２.６２.３异甘草苷１０.４４９４.４１.５９３.２２.３９２.２２.１９２.７２.０５２.２０９５.０１.６９４.８１.７９３.９２.２９２.５１.９１.５３９９１.９２.２９０.２２.６９３.６２.０９１.５２.５甘草查尔酮Ｂ７.６９３９３.８２.１９３.１２.０９２.２１.０９２.６２.７３８.４６９３.７２.４９１.５１.５９２.７２.４９４.１２.２１.８８１９５.５２.１８８.７３.２９２.２２.４９２.９２.０甘草素９.４０５９４.０２.３９１.８２.４９２.６２.５９３.１２.１４７.０２９４.６２.７９３.７１.９９３.０１.５９４.２１.９２.３６０９０.７３.１８８.３３.３９１.８３.０８９.５３.５甘草酸二钾１１.８０９２.９２.５９３.２２.７９２.２３.４９３.１２.６５９.００９２.５２.３９２.５３.０９２.６３.３９２.８２.７２.０３６８９.３２.２９０.９２.３９０.５２.３９１.３２.６异甘草素１０.１８９１.８１.１９１.５１.５８８.７２.２９１.４２.４５０.９０９０.８１.７９１.６０.９９１.２３.０９１.０２.３２.０１６９１.９２.２８９.３２.９９２.０２.８９１.７３.０甘草查尔酮Ａ１０.０８９３.６２.３９２.２２.１９２.７３.２９２.４３.１５０.４０９４.７２.１９３.１２.２９３.２２.５９２.８２.２２.１２２９０.８１.９８９.１２.９９２.９２.０９０.４３.０光甘草定１０.６１９４.５２.０９０.２１.２９１.６１.５９２.３２.８５３.０５９２.１１.４９２.５２.１９２.８１.８９１.４２.７表３㊀８种成分精密度考察名称峰面积ＲＳＤ(％)甘草苷０.７异甘草苷１.１甘草查尔酮Ｂ０.８甘草素１.２甘草酸二钾１.４异甘草素０.９甘草查尔酮Ａ１.１光甘草定１.２２.９㊀检出限与定量限㊀逐级稀释标准溶液ꎬ把信噪比(Ｓ/Ｎ)为３ʒ１时的浓度作为最低检出浓度ꎬ信噪比(Ｓ/Ｎ)为１０ʒ１时的浓度作为最低定量浓度ꎬ按称取０.５ｇ样品定容至１０ｍＬ进行计算ꎬ得到样品检出限和定量限ꎬ结果见表４ꎮ表４㊀８种成分检出限与定量限成分检出限/ｍｇ ｋｇ－１定量限/ｍｇ ｋｇ－１甘草苷０.５９１.８异甘草苷０.５２１.６甘草查尔酮Ｂ０.３８１.２甘草素０.１２０.４７甘草酸二钾０.５９１.８异甘草素０.１３０.５１甘草查尔酮Ａ０.５０１.５光甘草定０.１３０.５３２.１０㊀样品测定㊀对３０批美白类化妆品进行测定ꎬ４批样品含甘草酸二钾ꎬ含量在６.７５~３１２ｍｇ ｋｇ－１之间ꎻ５批样品含光甘草定ꎬ含量在１.９３~２３.９ｍｇ ｋｇ－１之间ꎻ其余６种成分未检出ꎮ典型样品色谱图见图１ꎮ混合标准品溶液色谱图见图１ꎮ３㊀讨论３.１㊀检测波长的选择㊀８种成分最大吸收波长有差异ꎬ用单一检测波长ꎬ很难兼顾每个成分的最佳检测灵敏度ꎬ故利用ＤＡＤ检测器的优点ꎬ设置多个波长进行检测ꎬ使各成分均在最佳灵敏度下被检测ꎮ试验对８种化合物在１９０~４００ｎｍ全波长范围扫描ꎬ在不考虑有较大干扰的末端吸收下ꎬ根据各成分的紫外吸收谱图来确定检测波长ꎮ结果表明:甘草苷在２３１ｎｍ波长处有最大吸收㊁甘草素和光甘草定在２３１ｎｍ波长附近有较强吸收ꎬ故选择２３１ｎｍ为检测波长ꎻ甘草酸二钾在２４９ｎｍ波长处有最大吸收ꎬ故选择２４９ｎｍ为检测波长ꎻ其余４种成分ꎬ异甘草苷在３６１ｎｍ波长处有最大吸收ꎬ甘草查尔酮Ｂ在３４０~３７０ｎｍ有最大吸收ꎬ异甘草素和甘草查尔酮Ａ在３６０~３８０ｎｍ有最大吸收ꎬ综合考虑灵敏度及化妆品中防腐剂等基质的干扰ꎬ其余４种成分选择３６５ｎｍ为检测波长ꎮ不同波长下８种成分的标准色谱图见图１ꎮ㊀１.甘草苷ꎻ２.异甘草苷ꎻ３.甘草查尔酮Ｂꎻ４.甘草素ꎻ５.甘草酸二钾ꎻ６.异甘草素ꎻ７.甘草查尔酮Ａꎻ８.光甘草定图１㊀８种混合标准品溶液色谱图３.２㊀流动相的选择㊀试验考察了乙腈－水㊁甲醇－水㊁乙腈－０.１％磷酸溶液㊁甲醇－０.１％磷酸溶液作为流动相时８种成分在相同色谱条件下的分离效果ꎮ结果显示ꎬ采用乙腈－０.１％磷酸溶液流动相进行分析时ꎬ基线平稳ꎬ分离度和峰形均较好ꎬ故选择该流动相系统ꎮ考察不同梯度洗脱程序ꎬ结果显示在最终确定的色谱条件下ꎬ８种成分在较短的洗脱时间内分离度良好ꎮ３.３㊀色谱柱的选择㊀对比ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８柱(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)㊁ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８柱(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)㊁Ｋｒｏｍａｓｉｌ１００－５－Ｃ１８柱(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)３种不同品牌色谱柱的分离效果ꎮ结果表明ꎬ使用ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８柱ꎬ待测组分分离度均较好ꎬ分离时间较短且峰形良好ꎬ故选择该色谱柱进行分析ꎮ３.４㊀前处理方法的研究３.４.１㊀提取溶剂的选择㊀本研究考察了甲醇浓度分别为９０％㊁７０％㊁５０％㊁３０％时ꎬ对４种不同基质样品的提取效果ꎮ结果发现９０％与７０％甲醇的提取效率较高ꎬ由于７０％甲醇提取的供试品溶液中干扰物质较少ꎬ且待测组分的峰形较好ꎬ故选用７０％甲醇溶液作为提取溶剂ꎮ乳液和膏霜类基质中ꎬ比较加入与不加入０.５ｍＬ饱和氯化钠水溶液ꎬ再进行超声提取ꎬ结果显示加入后提取效率显著提高ꎮ由于先加入饱和氯化钠水溶液ꎬ震荡混匀使样品变成流动状态ꎬ样品能够完全分散利于待测成分的释放ꎬ加速进入提取溶剂中ꎮ水剂和凝胶类基质加入饱和氯化钠水溶液后的提取效率ꎬ与不加无显著差异ꎮ３.４.２㊀提取方式与时间的选择㊀以７０％甲醇溶液作为提取溶剂ꎬ分别比较超声提取(５㊁１０㊁２０㊁３０ｍｉｎ)和震荡提取(０.５㊁１㊁２㊁３ｈ)对同一样品的提取效率ꎮ试验结果表明ꎬ超声提取优于振荡提取ꎻ超声提取２０ｍｉｎ时ꎬ各目标成分提取量最高ꎬ主要因为超声提取利用超声波产生的强烈震动及扩散效应ꎬ增加了溶剂穿透力ꎬ加速目标物扩散和溶解ꎮ最终试验选用超声提取２０ｍｉｎꎮ３.４.３㊀供试品溶液纯化方式的选择㊀供试品溶液提取㊁浓缩与定容之后ꎬ再用０.４５μｍ滤膜过滤后进样ꎬ样品图谱中干扰峰较多ꎬ背景噪声干扰较大ꎬ且有些供试品溶液在静置２ｈ后会析出絮状沉淀ꎮ考虑到化妆品成分的复杂性ꎬ本研究采用低温样品纯化ꎬ选择将供试品溶液－１８ħ冷冻１ｈꎬ在低温４ħ下６０００ｒ ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后过滤进样ꎬ可以有效降低基质类成分的干扰ꎮ３.５㊀结论㊀本研究建立了多波长ＨＰＬＣ－ＤＡＤ法同时测定化妆品中８种甘草化学成分的方法ꎬ方法学验证结果表明该方法准确可靠㊁灵敏度高ꎬ适用于化妆品中８种甘草化学成分的分析及定量检测ꎬ为化妆品原料和产品的监管提供技术支持ꎮ参考文献:[１]㊀胡耿ꎬ黄绮韵ꎬ张甜ꎬ等.甘草黄酮类化学成分研究[Ｊ].中草药ꎬ２０１９ꎬ５０(２１):５１８７－５１９２.[２]王建国ꎬ周忠ꎬ刘海峰ꎬ等.甘草的活性成分及其在化妆品中的应用[Ｊ].日用化学工业ꎬ２００４ꎬ３４(４):２４９－２５１. [３]张福欣ꎬ宋佳烜ꎬ刘晓东ꎬ等.甘草黄酮抗氧化及免疫活性[Ｊ].中国兽医学报ꎬ２０１９ꎬ３９(６):１１８０－１１８３. [４]包芳ꎬ白海英ꎬ彭静文ꎬ等.栽培甘草的化学成分及其抗菌活性研究[Ｊ].中国现代中药ꎬ２０１９ꎬ２１(５):５７７－５８２. 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