疟原虫镜检技术

1 疟原虫检验技术

梁平县疾病预防控制中心

何曦

血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响 检查的结果，必须把握好“三关”，即制片、染色和镜检。

一、 玻片清洁

玻片清洁。清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染污玻片。

1.新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。

2.使用过的载玻片的清洁方法有两种：

①5%的肥皂水煮沸法：

将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂 水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，用清洁干毛巾擦净后待用。

②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：

重铬酸钾 80g

2 浓硫酸 100ml

水(清净水)1000ml

配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。

二、制片

1.薄血膜涂制：

(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。

(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。

(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3 .1/4.火柴头大小。

(4)将推片臵于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法

ICS11.020

C62

WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准

WS/T 569—2017

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites

2017-08-01发布2018-02-01实施

前⾔

本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。

本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法1 范围

本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。

本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。2 术语和定义

下列术语和定义适⽤于本⽂件。2.1

疟原⾍Plasmodium spp

疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。2.2

⾎涂⽚ blood films

将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。3 仪器和器材

3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。

3.2 计数器。

3.3 载玻⽚（⽆划痕⽆油污的洁净载玻⽚）。

3.4 推⽚。

3.5 ⾎⽚染⾊架。

3.6 ⾎⽚⼲燥架。

3.7 玻⽚盒。

3.8 染⾊盘和染⾊缸。

4 试剂和材料

4.1 吉⽒染⾊原液。

4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

4.3 甲醇（分析纯）。

4.4 ⾹柏油或专⽤浸油（折射率≥1.5）。

4.5 ⼆甲苯（分析纯）。

疟原虫镜检操作流程

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一、准备工作阶段。

1 目 录

第一章 疟原虫生活史

一、概述

二、人体内发育

三、蚊体内的发育

第二章 疟原虫镜下形态

一、薄血膜中疟原虫形态

二、厚血膜中疟原虫形态

第三章 显微镜使用及维护

一、显微镜的构造

二、显微镜使用

三、使用注意事项

四、显微镜的维护保养

第四章 血片制作与染色

一、血片制作

二、血膜的染色

第五章 疟原虫镜检技术

一、血液

二、血液中各种正常细胞形态

三、薄血膜镜检

四、厚血膜镜检

五、杂质与疟原虫的鉴别

六、疟原虫计数

附录：疟原虫图谱 2 第一章 疟原虫生活史

一、概述

疟原虫是疟疾的病原体。疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。

疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。

二、人体内发育

疟原虫在人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。

（一） 红细胞外期

按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。成熟肝期裂殖体直径为45～60m，内含数以万计的肝期裂殖子。肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6～12天不等。