阿维菌素生物合成

学科综述阿维菌素生物合成张利平1,陈 川(河北大学生命科学学院,河北保定 071002) 摘 要:阿维菌素是迄今发现最有效的杀昆虫剂,杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一.本文综述了其生物合成的途径、生物合成的基因簇.通过对合成基因进行不断的分离与测序,现在基本上对每一步合成途径的基因及编码的酶都有所了解.这使得人们可阻断特定基因表达构建新型菌株,以增加有效组分及新型的抗生素的产出.另外还可通过化学修饰的方法来提高阿维菌素活性.关键词:阿维菌素;生物合成;基因改造中图分类号:Q 939.26. 文献标识码:A 文章编号:1000-1565(2002)02-0189-06阿维菌素是由除虫链霉菌(Strep tomy ces aver mitilis)产生的一类十六元大环内酯类抗生素.S trep to -my ces aver mitilis 最初是由美国Merck 公司研究者从一份来源于日本的土样中分离到的[1].阿维菌素具有广泛的抗寄生虫活性.虽然阿维菌素对细菌与霉菌无活性,但具有很强的驱虫和杀虫活性,并且抗寄生虫机制独特,与其它抗寄生虫药物无交叉耐药性[2].阿维菌素是迄今已发现最有效的杀昆虫剂、杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一.它除了是一种农用抗生素外,近些年来将B 1组分通过加氢还原得到的伊维菌素已成功用于人类蟠尾丝虫病的治疗.它主要作用于细胞膜上的离子通道,使阴离子汇集,引起细胞的超极化作用,造成多种线虫及节肢动物麻痹[3].野生菌发酵液中通常有8种组分A 1a ,A 2a ,B 1a ,B 2a ,A 1b ,A 2b ,B 1b ,B 2b .只有B 1a 和B 1b 可以作药用.尤以B 1a 活性最高.由于阿维菌素重要的生理活性和复杂的化学结构,引起人们极大的兴趣.阿维菌素为一种典型的次级代谢产物,生物合成复杂,原来人们通过对阿维菌素合成突变株的研究了解了其大概的合成途径,随着研究的不断深入,对合成基因已进行了不断的分离与测序,现在基本上对每一步合成途径的基因及其所编码的酶都有所了解.这使得人们可利用基因工程技术来构建工程菌,增加有效组分的产出和生产新型的阿维菌素.除了用生物方法,人们还通过化学修饰来产生抗虫活性更高的阿维菌素衍生物.avermect inR 1X -Y R 2A 1aCH 3CH=CH C 2H 5A 1bCH 3CH=CH CH 3A 2aCH 3CH 2-CH(OH)C 2H 5A 2bCH 3CH 2-CH(OH)CH 3B 1aH CH=CH C 2H 5B 1bH CH=CH CH 3B 2aH CH 2-CH(OH)C 2H 5B 2b H CH 2-CH(OH)CH 3 图1 阿维菌素结构式[2]Fig.1 Structural formulae for avermectins收稿日期:2001-12-20作者简介:张利平(1955-),女,河北保定人,河北大学教授,博士,主要从事微生物资源与遗传育种研究.第22卷 第2期2002年 6月河北大学学报(自然科学版)Journal of Hebei U niversity (Natural Science Edition)Vol.22No.2Jun.20021 阿维菌素的结构及理化性质阿维菌素是一组由十六元环内酯与一个二糖(齐墩果糖)所生成的苷(图1),在十六元环内酯周围还有一个含2个六元环的螺缩酮系及六氢苯并呋喃环系.根据C-5位上取代基的不同分为 A , B 组分;C-22和C-23之间单双键的差异分为 1 , 2 组分;C-25位上取代基的不同分为 a , b 组分.纯品为白色或浅黄色结晶,可溶于甲苯、乙酸乙酯、乙醇等溶剂,在水中溶解度极低[4].阿维菌素对酸敏感,用稀酸处理,引起C-13位上第一糖基的断开.此外,该类化合物对光敏感,如用紫外线照射,则可导致8、9和10、11之间双键的异构化[5].2 阿维菌素的生物合成[6]2.1 糖苷配基和双糖的合成通过同位素标记生物合成所需的前体物质对阿维菌素的渗入研究表明:配糖体骨架是由一个a 支链脂肪酸S(+)-甲基丁酰脂肪酸或异丁酰脂肪酸为起始,7个乙酸盐和5个丙酸盐头尾聚合而成.C-25位的不同的取代基分为a,b 组分,a 组分的二甲基丁酰基来源于S(+)-甲基丁酰CoA,b 组分的异丁酰基来源于异丁酰CoA.S(+)-甲基丁酰CoA,异丁酰CoA 分别由L-异亮氨酸、L-缬氨酸通过脱氨、转氨和脱羧作用形成.与糖苷配基相联的双糖分子为齐墩果糖,是由葡萄糖分子直接转化而来.2.2 阿维菌素的甲基化修饰与大环内酯C-5和双糖中的C-3 、C-3 相联的3个甲基都来源于蛋氨酸的5-甲基,并且双糖先进行甲基化,然后才连接到糖苷配基上.2.3 阿维菌素氧原子的来源糖苷配基中的氧原子来源于标记的乙酸盐和丙酸盐,C-21位的氧来源于二甲基丁酰基或异丁酰基,但苯并呋喃C-6和C-8a 之间的氧则不是,可能来源于分子态氧.2.4 阿维菌素合成途径北里研究所与Merk 公司分别分离到几种突变株,通过中间体转化与突变株的积累产物分析使阿维菌素的生物合成途径得以阐明.阿维菌素有8个组分,a 与b 的区别仅在起始物不同,其他部分完全一样,在这里仅讨论a 组分的合成.合成途径见图2,相应的b 组分由缬氨酸、异丁基酸盐等起始.C22-C23的双键的1组分由组分2脱水形成;B 组分通过阿维菌素BO-甲基转移酶而转变为 A 组分.3 Strep tomyces averm itilis 的阿维菌合成基因阿维菌素产生菌S.aver mitilis 属于革兰氏阳性丝状菌.它的染色体为线形,约8.7Mbp.因为其在生物合成中具有复杂的次级代谢方式而引起人们广泛的兴趣.Omura 和Ikeda 等人对S.aver mitilis 99%的基因进行分析,发现了25种次级代谢的基因簇.Ikeda H 等使用柯斯质粒文库和aveD 基因,运用染色体步移技术鉴定了整个阿维菌素合成主要基因簇[7].全部82.0kb 的序列被克隆和测序.他们并推断出在这个区域基因的组织形式.这82.0kb 的序列包括18个开放阅读框架(ORF)(见图3).根据基因的排列将分4个部分介绍[8].3.1 中心区4个阅读框架为聚酮合成酶基因其分为两组,aveA 1-ave A2和ave A3-ave A4,它们负责合成阿维菌素的聚酮部分.这些成簇的聚酮合成酶基因编码12个同源酶活性组件(PKS AVES),每一个都催化新一轮聚酮链的延伸.AVES1(6,8a-闭联-6,8a-脱氧-5-酮阿维菌素糖苷合成酶;414kDa)包含两个组件负责聚酮链的延伸.AVES 2(666kDa)包含3个组件使之延伸到C13,AVES 3(575kDa)包含4个组件使聚酮链延伸到C7.AVES 4(510kDa)包含 190 河北大学学报(自然科学版)2002年剩余的3个组件完成聚酮链的合成.比其他的抗生素如erythromycin,pikromycin 等的PKS 基因复杂得多.这4个酶具有55个活性位点构成了目前为止最为复杂的多酶体系.所有的组件都包括 -酮脂酰-ACP 合成酶、酰基转移酶和酰基转运蛋白(ACP)活性区域.图2 阿维菌素的合成途径[2,3]Fig.2 Pathway for avermectinbiosynthesis图3 阿维菌素合成基因簇图谱[8]Fig.3 Organization of the gene cluster for avermectin biosynethesis3.2 两套PKS 基因之间的2个开放阅读框架aveC 和aveE,分别与aveA2和aveA3相连,aveC 与aveA2的翻译相耦联.虽然aveC 的突变导致只产生组分 2 ,C22-C23为羟基,aveC 基因的氨基酸序列与脱水酶假定活性位点并不同源,aveC 的功能还不很清楚,可能与聚酮化合物的合成后修饰有关.测序显示aveE 与aveA3,aveA4在同一转录单位上.aveE 氨基酸序列的C 端与cytochrome p450羟化酶较为一致.它的功能可能是在C-8a 处烯丙甲基位引入一个氧原子封闭呋喃环. 191 第2期张利平等:阿维菌素生物合成3.3 PKS 基因右侧的9个开放阅读框架这些基因的序列与脱氧糖的合成酶和dTDP-糖转糖基酶相似.第一个阅读框架与aveA4相邻,与还原酶相似,但实际上在阿维菌素的合成中不起作用.在第一个阅读框架后的7个基因aveB ,aveB ,aveB ,aveB ,aveB ,aveB ,aveB 负责合成齐墩果糖和转糖基作用.3.4 PKS 基因左侧的3个开放阅读框架这3个开放阅读框架主要负责最初合成的糖基修饰.aveD 编码C5-O-甲基转移酶,它的活性需要S-腺苷甲硫氨酸.在aveD 的下游aveF 基因编码C-5酮还原酶,它在N 末端有NAD(P)H 结合基序.这与其他大环内酯类抗生素不同,除多功能的PKS 基因外,还有非PKS 酮还原酶的基因.当aveD 基因的启动子区被破坏,不仅使C5-O-甲基化的作用消失,而且aveF 的活性也随即消失,说明aveD 与aveF 基因为一个转录产物.aveR 与aveD-aveF 的转录方向相反.aveR 基因与rapmycin 合成菌的基因RapH 相似,主要作用为调控阿维菌素的合成.Ikeda 等人通过对阿维菌素合成基因的详细研究,使得从基因水平上改良生产菌株成为可能.根据基因图谱运用基因工程技术构建出新型高产菌株,还可能减少无用组分的产出.并且能使人们更好的了解链霉菌次级代谢基因的多样性与复杂性,也为研究其他链霉菌的次级代谢产物的产出提供了参考.4 阿维菌素生产菌的遗传改良4.1 选择性生产阿维菌素B 1a ,B 2aOmura [9]等将野生型菌株经NTG 诱变得到k2034,它缺乏阿维菌素BO-甲基转移酶活力(aveD-)只产生B 组分而不产生A 组分.另一突变株k2021能渗入L-异亮氨酸及相应的酮酸盐到阿维菌素的骨架中,而L-v al 则不能渗入,只产生a 组分.将两株不同组分缺陷的突变株进行原生质体融合,结果筛选到只产B 1a 、B 2a 的阿维菌素生产菌k 2038.4.2 选择性产生5-酮阿维菌素B 1a ,B 2aOmura 等还通过插入一段8Kbp 的片段改变了C5氧甲基化的基因操纵子,变更后的片段通过基因移位技术诱导到染色体的相应区域,经交叉重组以后构建了选择性产生5-酮阿维菌素B 1a ,B 2a 的菌株,为二步化学合成5-肟衍生物提供了方便,阿维菌素5-肟衍生物能增加阿维菌素的活力.4.3 选择性产生阿维菌素B 2aM rozik 已确立了从阿维菌素B 2a 通过化学方法产生C22-C23脱氢B 1a 即伊维菌素B 1a 的方法[10],因此阿维菌素B 2a 单组分产生菌被认为是工业化产生伊维菌素B 1a 的最有效的方法.Ikeda 等利用体内体外两种突变方法得到B 2a 单一组分产生菌.体内突变法是用NTG 处理上述构建的k2038,分离到单一组分的B 2a 产生菌H48,但产量低.体外突变法是由于阿维菌素的生物合成完整的基因簇已被克隆,参与C22-23脱氢的基因(aveC)被确定为4.82bp-BamHI 片段.通过对菌株k2038染色体上含有aveC 区左边克隆了一个经PCR 反应错配的一段碱基,通过基因移位技术在染色体相应的区域产生了移位或颠换突变,从而得到了只产生阿维菌素B 2a 的菌株[11].4.4 选择性产生6,8a-开环-6,8a-脱氧阿维菌素Pang 等人对k2038继续通过NTG 诱变得到了可产生6,8a-开环-6,8a-脱氧阿维菌素衍生物的突变株[12,13].H afner 等[14]用这类衍生物作为母体,合成得到了一系列新的6,8a-开环-6,8a-脱氧阿维菌素衍生物,它们具有潜在的生物活性.4.5 选择性产生C25不同的新型阿维菌素最初起始a 支链脂肪酸是由L-异亮氨酸、L-缬氨酸经 支链氨基酸转氨基酶和 支链氨基酸脱氢酶(BCDH )作用生成的(见图4),另外 支链脂肪酮酸还可重新合成[15].BCDH 为多酶复合物由bkdFGH 基因编码,有四个功能组件,脱氢酶和脱羧酶(E1a,E1b),二氢硫辛酰胺脱氢酶E2,二氢硫辛酰胺酰基转移酶E3.Hafner [16]等人通过化学突变得到了无BCDH 酶活性的突变株(bkd-),该突变株在向发酵培养基中添加 支192 河北大学学报(自然科学版)2002年链脂肪酸或含有异丙基和sec-丁基的前体物质时才能合成正常的阿维菌素,当只加入S(+)-甲基丁酰脂肪酸时,将只合成A 1a ,A 2a ,B 1a ,B 2a ;加入异丁酰脂肪酸时则只合成A 1b ,A 2b ,B 1b ,B 2b .当添加其它脂肪酸时可产生一系列25位不是异丙基和异丁基的新型阿维菌素,通过加入800种潜在的前体物,60多种新型阿维菌素被鉴定出来[17].并且Hafner 等得到了C5-O-甲基转移酶与 支链氨基酸脱氢酶的双重突变株(aveD -,bkd-),当加入S(+)-甲基丁酰脂肪酸时,只合成B 1a ,B 2a ;加入异丁酰脂肪酸时只合成B 1b ,B 2b ;加入环己基脂肪酸时则只会合成商业上一种重要的环己基阿维菌素B 1(doram ectin,多拉菌素).图4 阿维菌素的起始合成[15]Fig.4 Pathways of valine and isoleucine catabolism4.6 选择性产生阿维菌素B 2与B 1的比例降低的菌株野生型的Strep tomyces aver mitilis 合成的B 2与B 1的比例一般为2 1.如果能降低此比例将会减化工业上提取程序.Stutzman -Engw all 等人构建了一系列含有aveC 基因野生和突变阅读框的重组表达质粒,找到了可降低2 1比例的重组表达质粒.引入宿主后与宿主染色体发生重组最后得到了一系列组分比例降低的突变株,有的达到0.4 1左中[18].4.7 aveR 基因失活提高阿维菌素产量Stutzman -Engw al 等人克隆了两个基因aveR1、aveR2,这两个基因负责调控聚酮合成酶基因的表达与阿维菌素合成酶基因的表达.他们发现使这两个基因中的任何一个基因或同时两个基因失活将会使阿维菌素产量有大幅的提高.他们构建了这两个基因替换质粒载体pSE210、pSE214,与宿主染色体发生重组后分别得到了aveR1/aveR2基因缺失的和aveR2基因失活的突变株.突变株的产量比原来菌株提高了3.1- 3.4倍[19].5 阿维菌素的结构改造为了得到结构更稳定、杀虫活性更强,作用更安全的阿维菌素,研究者对阿维菌素结构修饰进行了广泛的研究.并且一些结构的修饰使其具有了新的性能.其中最成功的例子是对B 1组分C-22和C-23位双键选择性的还原形成依维菌素[1].依维菌素较阿维菌素具有较高的安全性,从而得到了大规模的商业生产.4 -氨基阿维菌素的发现使阿维菌素的活性得到了提高,该系列中最具活性的衍生物是4 -脱氧-4 -表甲氨基阿维菌素B 1.对阿维菌素结构改造主要包括羟基的改造、螺缩酮的改造、配基(内酯环)的改造和六氢苯 193 第2期张利平等:阿维菌素生物合成并呋喃环的改造.一般阿维菌素的结构改造不能破坏内酯环的构象,比如对螺缩酮、六氢苯并呋喃环的改造,因其均在内酯环外,对内酯环构象影响不大,所以这类衍生物基本能保持其生物活性.杂原子及杂环的引入也是对其结构改造的一个趋势[20,21].6 结语现在研究人员对阿维菌素合成途径的阐明,使得人们可在合成的任一步骤中引入突变,通过突变来得到新的高产和只产生特异性组分的菌株.在世界上许多国家相继出现抗阿维菌素类药物的虫株.频繁用药和亚剂量用药可能是导致抗药性产生的两大主要因素.只有不断通过基因工程和阿维菌素的结构化学改造,才能得到更稳定、更有效的阿维菌素.参 考 文 献:[1]徐志南,芩沛霖.阿维菌素研究进展[J].国外医药抗生素分册,1997,18(6):466-469.[2]吕淑君.阿维菌素的生物合成[J].国外医药抗生素分册,1997,18(2):114-118.[3]张之荫.阿维菌素在人类医学中的应用[J].国外医药抗生素分册,1996,17(1):47-55.[4]沈寅初,杨慧心.杀虫抗生素avermectin 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paper.Key words:biotechnology;fruit trees;summarize(责任编辑:赵藏赏)(上接第194页)[20]李友顺,梁晓梅,王道全.阿维菌素结构改造的新进展[J].化学通报,1999,1(1):45-50.[21]王道全.avermectins 的结构改造[J].北京农业大学学报,1994,20(4):431-437.Biosynthesis of the AvermetinsZHAN G L-i ping,CHEN C huan(College of Life Sciences,Hebei U niversity,Baoding 071002,China)Abstract:The avermetins are a group of closely ralated macrocylic lactones with exceeding ly high activity a -g ainst helminths and anthropods.This paper review the biosyntheticpathw ay of the avermectins and the organ-i zation of the biosynthetic gene cluster w hich many groups have analysed and cloned.According to the cloned gene cluster,people can use genetical technolog y to obtain the genetical strains w hich can produce more potent and non -tox ical avermectins and its derivatives.An ex tensive program of chemical modificaton can also be carried out to discover more active avermectins.Key words:avermectin;biosynthesis;gene -modification(责任编辑:陈 燕)201 第2期王俊丽等:生物技术在果树学研究中的应用。