蛋白质检测原理

可编辑word 一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① 技术（ ）

， ，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对进行激发，并检测是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

② 酵母双、三杂交技术（ ）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如4、4等都含有二个不同的结构域，即和。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有基因（假设为A载体），另一个含有基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵()，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：

可编辑word 由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：

如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段()和N端段()，并在C端段的N端接上一个16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。

将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。

分离纯化蛋白质的方法及原理

（一）利用分子大小

1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。

方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行

涉及的问题：

如何加快透析过程

（1） 加大浓度差，及时更换透析液

（2） 利用磁力搅拌器

常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成

2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上

3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。

结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来

（二）利用溶解度差别

4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。

5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析

（三）根据电荷不同

6、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。

氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力 （2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用

蛋白质的鉴定原理

蛋白质的鉴定原理可以通过多种方法进行，其中包括物理方法、化学方法和生物学方法。下面将详细介绍蛋白质鉴定的各种方法及其原理。

1. 物理方法：

物理方法主要是通过蛋白质的物理特性进行鉴定。包括分子量的测定、蛋白质的电泳、质谱等方法。

(1) 分子量的测定：分子量是蛋白质的一个重要特性，可以通过凝胶过滤、凝胶电泳、超高速离心等方法来测定。其中，凝胶电泳是一种常用的分析方法，通过将蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中，经过电泳后蛋白质在凝胶上的迁移距离与分子量呈正相关，可根据分子量标准曲线来确定待测蛋白质的分子量。

(2) 蛋白质的电泳：电泳是通过蛋白质在电场中的迁移来进行分离和鉴定的方法。主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳以及等电点电泳等。其中，SDS-PAGE是最为常用的蛋白质电泳方法，它通过在样品中加入吸附剂SDS来赋予蛋白质带电性，使得蛋白质在电场中按照大小分子量移动，从而实现分离和鉴定。

(3) 质谱法：质谱法是利用蛋白质的质量-电荷比进行分析的方法。常用的质谱方法有飞行时间质谱、质量分析检测和质谱成像等。质谱法可以测定分子量、氨基酸序列、修饰位点等信息，是蛋白质结构鉴定的重要手段。

2. 化学方法：

化学方法主要是通过蛋白质的化学性质进行鉴定。包括氨基酸分析、肽链测序等方法。

(1) 氨基酸分析：氨基酸分析是确定蛋白质的氨基酸组成和含量的方法。常用的方法包括离子交换色谱、氨基酸自动分析仪等。通过将蛋白质样品水解，分离出各种氨基酸，再经过定量分析得到各个氨基酸的含量，从而鉴定蛋白质的氨基酸组成。

(2) 肽链测序：肽链测序是通过逐步水解肽链中的氨基酸，利用一系列化学反应和质谱分析方法来确定蛋白质的氨基酸序列。常用的方法包括肽质谱法、域内肽定位法等。通过测定每个氨基酸的位置和序列，可以确定蛋白质的完整序列，从而进行鉴定。

3. 生物学方法：

生物学方法主要是通过蛋白质的生物学特性进行鉴定。主要包括免疫学方法、亲和层析、蛋白质互作等方法。

蛋白质功能性质的检测

班级：

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学号：

1、实验目的

通过本实验定性地了解蛋白质的主要功能性质。

2、实验原理

蛋白质的功能性质是指食品体系在加工、贮藏、制备和消费过程中蛋白质对食品产生需要特征的那些物理、化学性质。这些性质对食品的质量及风味起着重要的作用。蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。

蛋白质的功能性质可分为水化性质、表面性质、蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型。主要包括吸水性、溶解性、保水性、分散性、粘度和粘着性、乳化性、起泡性、凝胶作用等。蛋白质的功能性质及其变化规律非常复杂，受多种因素的相互影响，比如，蛋白质种类、蛋白浓度、温度、溶剂、pH、离子强度等。

本实验以卵蛋白为例，通过某些定性实验来认识蛋白质的主要功能性质。

3、实验材料、试剂和仪器

3.1 实验材料

（1） 2%蛋清蛋白溶液：取2g蛋清加98ml蒸馏水稀释，过滤取清夜。

（2） 卵黄蛋白：鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎。

3.2 试剂

(1) 硫酸铵、饱和硫酸铵溶液

(2) 氯化钠、饱和氯化钠溶液

(3) 花生油

(4) 酒石酸

3.3 仪器

(1) 刻度试管

(2) 100ml烧杯

(3) 冰箱

4、操作步骤

4.1 蛋白质水溶性的测定 在10ml刻度试管中加入0.5ml蛋清蛋白，加入5ml水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。

取上述蛋白质的氯化钠溶液3ml，加入3ml饱和硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白质在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。

4.2 蛋白质乳化性的测定

取0.5ml卵黄蛋白于10ml刻度试管中，加入4.5ml水和5滴花生油；另取5ml水于10ml刻度试管中，加入5滴花生油；再将两支试管用力振摇2~3min，然后将两支试管放在试管架上，每隔15min观察一次，共观察4次，观察油水是否分离。