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文章编号:1007-8738(2003)04-400-04TGF 2βR Ⅱ/Fc 融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定李圣青1,李焕章1,杨乔欣2,倪殿涛1(第四军医大学1西京医院呼吸内科,2基础部微生物学教研室,陕西西安710032)收稿日期:2002-12-23; 修回日期:2003-03-27作者简介:李圣青(19702),女,安徽芜湖人,博士生.Tel.(029)3375237/3373682Purif ication and characterization of thef usion protein TGF 2βR Ⅱ/FcL I S heng 2qi ng 1,L I Huan 2z hang 1,Y ang Qiao 2xi n 2,N I Dian 2tao11Department of Respiration ,Xijing Hospital ,2Department of Mi 2crobiology ,Fourth Military Medical University ,Xi ’an 710032,ChinaAbstractAIM :T o expre ss the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc in largeamounts by using recombinant Bac 2TR Ⅱbaculovirus expre ssion system constructed by our laboratory and to purify and charac 2terize it.Then ,to verify whether the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can be able to block the biological activity of cytokine TGF 2β1.METH ODS :The viral titer was determined by plaque form 2ing te st.The recombinant baculovirus was amplified by in fecting sf9cells.The fusion protein was purified by FPLC using protein G column.The purified product was analyzed by SDS 2PAGE and the amount of target protein calculated by gray scanning.We st 2ern blot and sandwich E LISA were used to affirm the expre ssion of the fusion protein.MTT colorimetry was used to te st whetherthe fusion protein can block the inhibition effect of cytokine TG F 2β1on the growth of L929cells.I t was to verify whether the fusion protein can reduce the fibronectin production in L929cells ac 2celerated by TGF 2β1by we stern blot.RESU LTS :The titer ofrecombinant Bac 2TR Ⅱbaculavirus in the primary culture fluid was 2×1012pfu/L.A fter electrophore sis ,gray scanning analy 2sis showed that the target protein accounted for 10percent of the total protein.We stern blot analysis and sandwich E LISA de 2tection proved that the target protein has been expre ssed.The fusion protein could block the inhibitive effect of cytokine TGF 2β1on the growth of L929cells and fibronectin production in L929cells.CONC L USION :The fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can in 2hibit the biological activity of TGF 2β1in vitro.This study will behelpful to the mass production of the fusion protein ,and will fa 2cilitate its further use in the therapy of pulmonary fibrosis.K eyw ords :transforming growth factor 2beta ;pulmonary fibrosis ;fusion protein摘要目的:用重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc ,并对其进行纯化及鉴定;验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF 2β1的生物学作用。
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张久盘ꎬ宋雅萍ꎬ姜㊀超ꎬ等.牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０３.０１６牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析张久盘１ꎬ宋雅萍２ꎬ姜㊀超２ꎬ王㊀锦１ꎬ魏大为２(１.宁夏农林科学院动物科学研究所ꎬ宁夏银川７５０００２ꎻ２.宁夏大学农学院ꎬ宁夏银川７５００２１)收稿日期:２０２２￣０６￣１５基金项目:宁夏自然科学基金项目(２０２１ＡＡＣ０５００７)ꎻ宁夏重点研发计划项目(２０２０ＢＥＢ０４０１１)ꎻ宁夏青年科技人才托举工程项目(ＴＪＧＣ２０１９０７６)作者简介:张久盘(１９８５－)ꎬ女ꎬ河南商丘人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为动物遗传育种ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｊｉｕｐａｎ＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:魏大为ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｅｉｄａｗｅｉｗｄｗ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀本研究旨在探究牛ＬＡＴＳ２基因组织表达规律ꎬ利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子ꎬ以阐明牛ＬＡＴＳ２基因的转录调控机制ꎮ利用ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测牛ＬＡＴＳ２基因在心㊁脾㊁肝㊁肾㊁肺㊁背最长肌㊁皮下脂肪㊁皱胃㊁大肠及睾丸等中的相对表达量ꎬ构建ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎮ克隆ＬＡＴＳ２基因５ᶄ端非翻译区上游１.７ｋｂ序列ꎬ利用逐段缺失引物ꎬ巢式扩增其７个启动子区不同截断体缺失片段(－１７９２~＋１７９㊁－１４７５~＋１７９㊁－１０９８~＋１７９㊁－７２７~＋１７９㊁－５１５~＋１７９㊁－２４８~＋１７９和－５６~＋１７９)ꎬ并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ上ꎮ重组的ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)细胞系ꎬ鉴定其启动子核心区域ꎮ进一步借助在线软件ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)分析启动子核心区域序列特征ꎬ并预测关键转录因子结合位点ꎮ结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎻＬＡＴＳ２蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为１支ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ蛋白质互作分析筛选出的与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁ＭｙｏＧ和Ｍｙｏｄ１的结合位点ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础ꎮ关键词:㊀牛ꎻＬＡＴＳ２基因ꎻ组织表达ꎻ启动子ꎻ转录调控中图分类号:㊀Ｓ８２３.８＋１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０３￣０７５３￣０９ＰｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅＺＨＡＮＧＪｉｕ￣ｐａｎ１ꎬ㊀ＳＯＮＧＹａ￣ｐｉｎｇ２ꎬ㊀ＪＩＡＮＧＣｈａｏ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＪｉｎ１ꎬ㊀ＷＥＩＤａ￣ｗｅｉ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＮｉｎｇｘｉａＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＮｉｎｇｘｉａＵｎｉ￣ｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５００２１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎬａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓꎬｓｏａｓｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｈｅａｒｔꎬｓｐｌｅｅｎꎬｌｉｖｅｒꎬｋｉｄｎｅｙꎬｌｕｎｇꎬｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅꎬｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｆａｔꎬａｂｏｍａｓｕｍꎬｌａｒｇｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｔｅｓｔｉｓｂｙＲＴ￣ｑＰＣＲꎬａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｏｆＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.Ｔｈｅ１.７ｋｂｓｅｑｕｅｎｃｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｓｅｖｅｎｓｅｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈ－１７９２－＋１７９ꎬ－１４７５－＋１７９ꎬ－１０９８－＋１７９ꎬ－７２７－＋１７９ꎬ－５１５－＋１７９ꎬ－２４８－＋１７９ａｎｄ－５６－＋１７９ｍｉｓｓｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｕａｌ￣ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＣ２Ｃ１２ａｎｄ３Ｔ３￣Ｌ１ｃｅｌｌｌｉｎｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ.Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｏｎｌｉｎｅｓｏｆｔｗａｒｅ３５７ＧｅｎｏｍａｔｉｘａｎｄＪＡＳＰＡＲꎬｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｐｌｅｅｎ(Ｐ<０ ０１).Ｒｕｍｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｕｍｉｎａｎｔｓ.ＴｈｅｔｏｐｔｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓｃｌｏｓｅｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＨｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.ＴｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔ－２４８－－５６.Ｉｔｗａｓｐｒｅｄｉｃ￣ｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｈａｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓＴＥＡＤ１ꎬＭＥＦ２ＡꎬＦＯＳＬ１ꎬＭｙｏＧａｎｄＭｙｏｄ１ｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅ￣ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｏｖｉｎｅｍｕｓｃｌｅ.Ｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏ￣ｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｍｕｓｃｌｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃａｔｔｌｅꎻＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎻｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｐｒｏｍｏｔｅｒꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ其生长发育直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬ骨骼肌的生物学特性是衡量家畜潜在经济性能的标准[１]ꎬ另外ꎬ骨骼肌是动物体动作和能量代谢的主要参与者ꎬ在机体的代谢平衡维持中起十分重要的作用[２]ꎮ骨骼肌发生发育过程极其复杂精细ꎬ从静息肌卫星细胞的激活㊁成肌细胞的增殖分化ꎬ到肌纤维形成的终末阶段[３￣４]ꎬ全过程除了受遗传㊁环境及营养水平调控外ꎬ更多取决于基因的控制[５]ꎬ且细胞信号分子㊁转录因子㊁非编码ＲＮＡ等诸多调节因子精准地参与其中复杂的网络调控[６￣１１]ꎮ目前ꎬ为促进骨骼肌的生长发育以改善肉质从而实现肉牛的遗传改良ꎬ基因的功能鉴定和筛选已成为一种热门且有效的手段ꎮ哺乳动物中调节细胞生长的Ｈｉｐｐｏ信号通路十分保守ꎬ通过关键因子Ｓａｌｖａｄｏｒ１(Ｓａｖ１)㊁ＭＳＴ１/ＭＳＴ２㊁Ｙｅｐ等相关基因及大肿瘤抑制基因１/２(ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２)调控细胞的增殖㊁分化㊁凋亡以及干细胞的自我更新ꎬ从而实现对器官体积大小的控制[１２￣１３]ꎮＬＡＴＳ２基因作为Ｈｉｐｐｏ信号通路的核心成员之一ꎬ与通路中的其他关键因子共同调控动物体器官的生长发育ꎬ主要表现在影响心脏肌肉的发育[１４￣１５]ꎮ目前ꎬ关于ＬＡＴＳ２基因功能研究主要集中在其参与肿瘤细胞发生及调控细胞增殖的机理方面[１６￣１８]ꎬ但ＬＡＴＳ２基因对动物体骨骼肌生长发育中的调控有重要作用且研究较少ꎮ王利宏等[１９]㊁鲍建军等[２０]发现ＬＡＴＳ２基因多态性与湖羊肌肉生长发育有显著关联ꎬ同时还发现ＹＡＰ１基因在正常表型羊和双肌臀羊中的表达存在差异ꎬ且ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２基因可与ＹＡＰ１基因互作抑制肌肉生长发育[２１]ꎮ此外ꎬ我们前期研究发现ＬＡＴＳ１基因在牛背最长肌等多个组织中高表达ꎬ且其核心启动区结合了肌肉生长发育相关的Ｍｙｏｄ１和ＭＥＦ２Ａ转录因子并调控其转录活性ꎬ初步阐明了ＬＡＴＳ１基因参与牛的肌肉生长发育转录调控机制[２２]ꎮＬＡＴＳ２基因与ＬＡＴＳ１基因同属ＬＡＴＳ基因家族ꎬ其分子序列及结构相似ꎬ因此我们推测ＬＡＴＳ２在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎬ但其转录机制不清ꎮ鉴于此ꎬ本研究拟构建ＬＡＴＳ２基因在牛不同肌肉组织或器官中的表达谱ꎬ克隆并鉴定其启动子核心区域ꎬ预测ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的关键转录因子ꎬ以期为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育过程中的转录调控机制奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验样品采集３头２０月龄秦川牛公牛的肝(右叶)㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺(中叶)㊁肾(皮质)㊁皮下脂肪㊁心(心房)㊁皱胃(胃壁)㊁大肠(盲肠段)㊁脾(实质)和颈部静脉血样ꎬ迅速置于液氮带回实验室备用ꎮ１.２㊀主要试剂ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体㊁ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ㊁基因组ＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＨ５α感受态细胞㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁限制性内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁ＲＮＡ提取试剂盒㊁反转录及荧光定量试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司ꎻ去内毒质粒提取试剂盒购自ＯｍｅｇａＢｉｏ￣Ｔｅｋ公司ꎻＤｕａｌ￣Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ双荧光素酶报告系统购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)㊁ＯＰＴＩ￣ＭＥＭ㊁Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅ￣ａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒及胎牛血清(ＦＢＳ)购自赛默飞世尔科技公司ꎻ双荧光检测试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ及ｐＲＬ￣４５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ＴＫ载体㊁小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)为本实验室保存ꎮ１.３㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测首先提取不同组织或器官总ＲＮＡꎬ并按照反转录试剂盒说明书将各个ＲＮＡ进行反转录ꎬ检测ｃＤ￣ＮＡ质量ꎮ利用Ｐｒｉｍｅｒ５.０软件设计ＲＴ￣ｑＰＣＲ引物ꎬ以ＧＡＰＤＨ作为内参基因(引物见表１)ꎬ使用７５００ＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅ仪器(美国应用生物系统公司产品)进行定量ＰＣＲꎮ反应总体系为２０ ０μｌꎬ其中上/下游引物各０ ８μｌ(引物浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)㊁ｃＤＮＡ模板２ ０μｌ(模板质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)㊁ＰｒｉｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０ ０μｌ㊁ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅⅡ０ ４μｌꎬ剩余用ｄｄＨ２Ｏ补齐ꎮＲＴ￣ｑＰＣＲ反应程序为:９５ħ预变性３０ｓꎻ９５ħ变性５ｓꎬ６０ħ退火３４ｓꎬ循环４０次ꎬ生物学重复３次ꎬ采用２－әәＣｔ法处理分析相对表达量数据[２３]ꎬ数据采用ＳＰＳＳ２０.０软件进行单因素差异性分析ꎮ１.４㊀生物信息学分析结合ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)及ＵＣＳＣ(ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/)网站参考牛基因组信息ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因启动子区域ꎮ利用Ｕｎｉｐｒｏｔ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)和ＭＥＧＡ５.０(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)构建出ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎬ使用ＥｘｃｅｒｔＳｙＰｒｏｔＰａｒｍ(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线程序进行蛋白质序列分析ꎬ使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎮ１.５㊀启动子克隆及逐段缺失片段扩增根据牛ＬＡＴＳ２基因启动子序列信息ꎬ设计其启动子全长扩增引物ＬＡＴＳ２￣ＰＦ/ＰＲ(表１)ꎬ引物长度为１９７２ｂｐꎬ包括－１７９２~＋１７９序列ꎮ以基因组ＤＮＡ为模板ꎬ参考ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ操作手册进行ＰＣＲꎬ总体系２０ ０μｌꎬ其中ꎬ４ ０μｌｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅꎬ１０ ０μｌ２ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒꎬ上/下游引物各０ ８μｌ(浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１ ０μｌＰｒｉｍｅ￣ＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡ聚合酶ꎬ底物１ ０μｌ(质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)ꎬ２ ４μｌｄｄＨ２ＯꎮＰＣＲ扩增程序使用３步法:９８ħ１０ｓꎬ６０ħ２０ｓꎬ６８ħ１５ｓꎬ循环３５次ꎮＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ预期片段纯化回收后与ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体连接ꎬ转化后筛选阳性克隆进行测序鉴定ꎮ根据测序结果ꎬ设计５ᶄ端逐段缺失片段的上游引物(Ｆ１~Ｆ７)和１条固定的下游引物(Ｒ)ꎬ在引物５ᶄ端添加ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切位点(表１)ꎬ以ＬＡＴＳ２基因－１７９２~＋１７９序列为模板进行缺失片段的ＰＣＲ扩增反应(扩增体系㊁程序同上)ꎬ将扩增片段分别连接ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体进行测序鉴定ꎮ得到的逐段缺失片段分别命名为:ＬＡＴＳ２￣Ｐ１㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ２㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ３㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ４㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ５㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ６和ＬＡＴＳ２￣Ｐ７ꎮ表１㊀引物信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ项目㊀引物名称㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增片段长度(ｂｐ)扩增区域收录号荧光定量ＰＣＲＧＡＰＤＨ￣ＦＧＡＰＤＨ￣ＲＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ６０.０８０３２０~５２１ＮＭ＿００１０３４０３４.２ＬＡＴＳ２￣ＦＬＡＴＳ２￣ＲＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧ６０.０１３１３２１３~３３４４ＸＭ＿０２５００００９２.１启动子区域克隆ＬＡＴＳ２￣ＰＦＬＡＴＳ２￣ＰＲＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴ６５.５１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ１ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＧ６１.０１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ２ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣ６０.５１６５５－１４７５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ３ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＡＣＣＣ６１.５１２７８－１０９８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ４ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴ６４.０９０７－７２７~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ５ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡ６２.５６９５－５１５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ６ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣ６０.０４２８－２４８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ７ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧ５９.５２３６－５６~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣ＲＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴＮＣ＿０３７３３６.１Ｆ为上游引物ꎬＲ为下游引物ꎬ斜体碱基表示ＫｐｎⅠ(ＧＧＧＧＴＡＣＣ)和ＸｈｏⅠ(ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ)酶切位点ꎮ５５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析１.６㊀双荧光素报告载体构建使用内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体在３７ħ条件下酶切１ｈꎬ酶切完成后进行目的片段纯化回收ꎮ进一步将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段分别和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶(１６ħ条件下)连接１ｈꎮ将产物转化至ＤＨ５α感受态细胞培养后筛选阳性克隆并鉴定ꎬ进一步使用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ备用ꎮ１.７㊀细胞培养、转染及测定酶活性复苏Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ培养基为１０％胎牛血清(ＦＢＳ)＋９０％ＤＭＥＭ培养基ꎬ待其生长状态良好且密度达到７０％~８０％后进行传代培养ꎮ传代生长后选择形态良好的细胞进行２４孔板铺板ꎬ按照Ｌｉｐｏ￣ｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒说明书ꎬ分别将构建好的双荧光素报告载体ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ７８００ｎｇ重组质粒和２０ｎｇ内参质粒ｐＲＬ￣ＴＫ共转染至Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ进行３次重复ꎬ阴性对照为ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒ꎮ在转染４８ｈ后进行细胞收集ꎬ利用双荧光检测试剂盒进行荧光素酶和海肾荧光素酶活性测定ꎬ计算二者的比值ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域ꎮ１.８㊀关键转录因子预测通过ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)在线软件分析启动子核心区域序列ꎬ预测阈值设置为９０％以上ꎬ选取２个网站预测结果的共同部分ꎬ筛选ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域关键的转录因子结合位点ꎮ１.９㊀数据分析数据结果以平均值ʃ标准差表示ꎬ数据显著性检验使用ＳＰＳＳ１８.０软件进行单因素方差分析(Ｐ<０ ０１为差异极显著ꎻＰ<０ ０５为差异显著)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＬＡＴＳ２基因组织表达规律㊀㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ结果(图１)显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中均检测出表达信号ꎬ以脾中的表达量作为对照ꎬ该基因在肝和背最长肌中的表达极显著地高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎬ其次在睾丸中高表达(Ｐ<０ ０５)ꎬ在肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中表达量较低ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｒｏｒｇａｎｓｏｆｃａｔｔｌｅ２.２㊀牛ＬＡＴＳ２基因的结构特征及进化树构建ＬＡＴＳ２基因位于第１２号染色体ꎬ全长５１０９６ｂｐꎬ包括９个外显子和８个内含子ꎬ共转录３０４８ｂｐ的ｍＲＮＡ序列ꎬ可编码１０１５个氨基酸(图２)ꎬＬＡＴＳ２蛋白分子式为Ｃ４８８２Ｈ７６２８Ｎ１４１８Ｏ１４２５Ｓ３５ꎬ其相对分子质量为１１０１１０ꎬ等电点(ｐＩ)为８ ８４ꎮ㊀㊀以ＬＡＴＳ２蛋白序列为对象ꎬ利用ＭＥＧＡ５.０软件构建牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种的系统进化树(图３)ꎮ构建出的系统进化树表明ＬＡＴＳ２蛋白在牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种中进化较为保守ꎬ反刍动物在进化过程中单独聚为１支ꎬ上述结果表明ＬＡＴＳ２具有重要功能且在反刍动物进化过程中极度保守ꎮ２.３㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白互作分析使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎬ得到图４所示的蛋白质互作网络ꎮ网络中与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质分别为ＹＡＰ１㊁ＭＯＢ１Ａ㊁ＭＯＢ１Ｂ㊁ＳＡＶ１㊁ＡＭＯＴＬ２㊁ＷＷＣ１㊁ＷＷＴＲ１㊁ＡＭＯＴ㊁ＡＭＯＴＬ１㊁ＮＦ２ꎬ分析其信息ꎬ与ＫＥＧＧ收录的Ｈｉｐｐｏ信号通路成员及Ｂｉｏｇｒｉｄ收录的与ＹＡＰ１互作的蛋白质进行比对后ꎬ发现筛选出的上述蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮ２.４㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域鉴定通过ＰＣＲ扩增到牛ＬＡＴＳ２基因启动子１.７ｋｂ序列ꎬ根据逐段缺失引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ获得７个逐段缺失的ＬＡＴＳ２基因启动子片段(逐段缺失片段扩增电泳见图５)ꎮ进一步连接ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体ꎬ构建得到了逐段缺失重组质粒ꎬ将其命名为:ｐＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２６５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期图２㊀牛ＬＡＴＳ２基因结构示意图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图３㊀基于牛ＬＡＴＳ２蛋白序列构建进化树Ｆｉｇ.３㊀ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ图４㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白相互作用预测Ｆｉｇ.４㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｉｎｃａｔｔｌｅ－７２７~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９和ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９ꎮ测序鉴定后ꎬ使用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体分别将ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒和７个重Ｍ:ＤＬ４５００ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１~７分别为ＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５６~＋１７９扩增片段电泳图ꎬ片段长度分别为１９７２ｂｐ㊁１６５５ｂｐ㊁１２７８ｂｐ㊁９０７ｂｐ㊁６９５ｂｐ㊁４２８ｂｐ㊁２３６ｂｐꎮ图５㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子逐段缺失片段扩增电泳图Ｆｉｇ.５㊀ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ组质粒转染至３Ｔ３￣Ｌ１和Ｃ２Ｃ１２细胞系ꎬ检测启动子的活性ꎮ相对荧光素酶活性数值(图６)显示ꎬＬＡＴＳ２基因７５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析启动子区域的１ ７ｋｂ序列在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均有较高的转录活性ꎮ当缺失－１０９８~－７２７片段后ꎬｐＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２细胞系中显著下降(Ｐ<０ ０５)ꎻ进一步缺失启动子片段－２４８~－５６ꎬ发现ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均极显著下降(Ｐ<０ ０１)ꎬ分别下降了７９ ４％和７５ ６％ꎮ上述研究结果表明ꎬＬＡＴＳ２基因启动子区域的１ ７ｋｂ序列活性较高ꎬ具备调控基因转录活性的功能ꎻ－２４８~－５６为ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域ꎻＬＡＴＳ２基因在Ｃ２Ｃ１２细胞系的转录活性高于３Ｔ３￣Ｌ１ꎮ２.５㊀启动子核心区域的关键转录因子鉴定利用Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ和ＪＡＳＰＡＲ软件对ＬＡＴＳ２基因启动子区和核心区域(－２４８~－５６)进行分析并对潜在的关键转录因子进行预测ꎬ结果(图７)显示ꎬＬＡＴＳ２基因启动子核心区域包含转录增强因子ＴＥＦ１(ＴＥＡＤ１)㊁肌肉细胞特异性增强因子２Ａ(ＭＥＦ２Ａ)㊁ＦＯＳ样抗原１(ＦＯＳＬ１)㊁肌细胞生成素(Ｍｙｏｇ)和生肌决定因子(Ｍｙｏｄ１)ꎬ初步推测转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１可能对ＬＡＴＳ２基因的转录活性有重要的调控作用ꎮ左边为ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素逐段缺失片段示意图ꎬ右边为酶活性检测数值ꎮＬｕｃ表示双荧光素酶报告载体ꎮＣ２Ｃ１２表示小鼠成肌细胞ꎻ３Ｔ３￣Ｌ１表示小鼠脂肪细胞ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图６㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域缺失片段报告载体相对荧光素酶活性Ｆｉｇ.６㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｄｅｌｅｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒ３㊀讨论骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ占胴体质量的４０％左右ꎬ其发育程度直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬＬＡＴＳ２基因对细胞的增殖㊁凋亡以及骨骼肌的形成有重要的调控作用ꎬ而调控机制并不清楚ꎮ已有文献报道ꎬＬＡＴＳ１基因[２１]㊁ＬＡＴＳ２基因[１９]与湖羊肌肉生长发育显著相关ꎮ因此ꎬ本试验开展了牛ＬＡＴＳ２基因有关研究ꎬ成功克隆了牛ＬＡＴＳ２基因启动子ꎬ检测了启动子活性并鉴定到启动子核心区域ꎬ预测到该基因启动子核心区域中的重要转录因子ꎬ为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ本研究中ꎬ牛ＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾等不同组织或器官中均有表达ꎬ在肝中的表达量最高ꎬ背最长肌其次ꎬ在心㊁肺㊁皮下脂肪㊁肾㊁皱胃㊁大肠和脾等组织或器官中相对表达量较低ꎮ上述研究结果表明ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的相对表达量有差异ꎬ该基因的高表达可能影响肝以及肌肉组织的８５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期下划线为引物序列ꎬ方框表示相对应的转录因子结合位点ꎬ箭头指示转录起始位点ꎮＦＥＡＤ１:转录增强因子ＴＥＦ１ꎻＭＥＦ２Ａ:肌肉细胞特异性增强因子２ＡꎻＦＯＳＬ１:ＦＯＳ样抗原１ꎻＭｙｏｇ:肌细胞生成素ꎻＭｙｏｄ１:生肌决定因子ꎮ图７㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的转录因子预测Ｆｉｇ.７㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ正常发育ꎬ这同ＬＡＴＳ２基因表达量与湖羊肌肉生长发育显著相关[１９]的结果一致ꎮ系统进化树结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ预测出的前１０种互作蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中重要的转录调控因子ꎮＨｉｐｐｏ通路的核心是一个激酶级联反应ꎬ其中ꎬＳＡＶ１和ＭＯＢ１形成一种复合体并在细胞质中被磷酸化来调控ＬＡＴＳ１/２表达ꎬ待ＬＡＴＳ１/２被激活后ꎬ其激酶反过来去磷酸化并抑制转录共激活因子ＹＡＰ和ＴＡＺꎮ去磷酸化的ＹＡＰ/ＴＡＺ进入细胞核后与ＴＥＡＤ１￣４等多种转录因子发生互作ꎬ从而抑制凋亡的基因表达并诱导细胞增殖[２４￣２５]ꎮ研究发现ＬＡＴＳ１/２和Ｍｓｔ１/２可通过ＫＩＢＲＡ㊁ＮＦ２㊁ＲＡＳＳＦ等多种上游信号分子调控Ｈｉｐ￣ｐｏ信号通路的活性ꎬ如ＡＭＯＴ等因子通过结合ＬＡＴＳ１/２将ＹＡＰ/ＴＡＺ等因子紧密连接在细胞质中ꎬＹＡＰ/ＴＡＺ的磷酸化可进行细胞信号调控ꎮＹＡＰ/ＴＡＺ和ＬＡＴＳ１/２的稳定性可通过蛋白质泛素化进行调控[２６]ꎮ综上ꎬＬＡＴＳ２基因在细胞信号转导及细胞增殖分化中起重要作用ꎮ通过启动子逐段缺失载体活性检测ꎬ发现牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ进一步预测牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域有ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１等转录因子结合位点ꎮ研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１可调控肌肉特异性基因ＴＮＮＴ２㊁Ｍｈｃ㊁α￣ａｃｔｉｎ[２７]和ＣＯＬ１Ａ１[２８]的表达ꎬ在心肌㊁骨骼肌㊁平滑肌的发育方面有至关重要的调控作用[２７￣２９]ꎮＴＥＡＤ１蛋白还可以与Ｈｉｐｐｏ信号通路中ＹＡＰ蛋白形成蛋白质复合物ꎬ从而抑制细胞增殖㊁促进细胞凋亡[３０]ꎮＭＥＦ２Ａ作为肌肉发生的重要核心因子ꎬ对骨骼肌和心肌细胞的增殖和分化有重要调控作用[３１]ꎬ同时能够促进生长因子㊁肌球蛋白重链及胶原对损伤骨骼肌的修复[３２]ꎻ该因子能够特异性识别并结合大多数肌肉基因启动子中的Ａ/Ｔ序列ꎬ从而增强相关基因的表达[３３]ꎮＦＯＳＬ１是转录因子ＡＰ￣１复合体的组分之一ꎬ参与细胞的增殖和分化ꎬ抑制细胞凋亡ꎬ可介导Ｋｒａｓ通路调控细胞周期蛋白质ꎬ诱导骨骼的发育[３４]ꎮＭｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１作为调控肌肉细胞增殖㊁分化及肌纤维形成的关键基因[３５]ꎬ突变会显著影响肌肉纤维和肉质特性[３６]ꎮ其中ꎬＭｙｏｄ１对发育初级阶段肌肉的可塑性和再生起关键作用[３５]ꎬ当Ｍｙｏｄ１与ＰＡＸ７共表达时ꎬ可激活基底膜静息的肌肉卫星细胞使其增殖[３７]ꎻＭｙｏｇ通过调节肌肉肌酸激酶影响骨骼肌的发生发育[３８]ꎬ研究结果表明ꎬ敲除小鼠Ｍｙｏｇ基因后骨骼肌发育受损ꎬ出生后肌肉会出现萎缩现象[３９]ꎮ以上研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子在个体生长发育以及肌肉形成过程中起重要作用ꎬ结合本研究关于转录因子结合位点的预测ꎬ我们可以推断出上述５种转录因子对ＬＡＴＳ２基因的转录可能起重要调控作用ꎮ但对于这一推断将来还需要结合定点突变㊁凝胶迁移(ＥＭＳＡ)㊁染色质免疫共沉淀(ＣｈＩＰ)等技术手段进行深入研究ꎮ４㊀结论牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ启动子核心区域预测到ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁９５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子结合位点ꎮＬＡＴＳ２基因的组织表达规律㊁启动子核心区域的转录因子结合位点预测及ＬＡＴＳ２蛋白互作分析结果均表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＥＲＲＹＤＰꎬＷＡＬＬＥꎬＰＲＹＣＥＪＥ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｄａｉｒｙａｎｄｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ａｎｉｍａｌ:ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１４ꎬ８(１):１０５￣１２１. [２]㊀ＨＪＯＲＴＨＭꎬＰＯＵＲＴＥＹＭＯＵＲＳꎬＧÖＲＧＥＮＳＳＷꎬｅｔａｌ.Ｍｙｏ￣ｓｔａｔｉｎｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｈｙｓｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｙｓｇｌｙｃａｅｍｉａａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０１６ꎬ２１７(１):４５￣６０.[３]㊀ＦＲＯＮＴＥＲＡＷＲꎬＯＣＨＡＬＡＪ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ:ａｂｒｉｅｆｒｅｖｉｅｗｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｓｕｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１５ꎬ９６(３):１８３￣１９５.[４]㊀ＴＡＪＢＡＫＨＳＨＳ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｖｅｒ￣ｓｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２００９ꎬ２６６(４):３７２￣３８９.[５]㊀ＢＯＵＫＨＡＡꎬＢＯＮＦＡＴＴＩＶꎬＣＥＣＣＨＩＮＡＴＯＡꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｃａｒｃａｓｓａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｏｆｄｏｕｂｌｅｍｕｓｃｌｅｄＰｉ￣ｅｍｏｎｔｅｓｅｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１１ꎬ８９(１):８４￣９０. [６]㊀ＷＥＩＤＷꎬＦＥＮＧＬＳꎬＺＨＡＮＧＷＺꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＳＩＸ４:ｒｏｌｅｓｏｆＥ￣ｂｏｘａｎｄＭｙｏＤｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂａｓａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ￣ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２０１８ꎬ４９６(１):４４￣５０. [７]㊀ＷＥＩＤＷꎬＭＡＸＹꎬＺＨＡＮＧＳꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＳＩＸ１ｇｅｎｅ:ｒｏｌｅｓｏｆＭｙｏＤꎬＰＡＸ７ꎬＣＲＥＢａｎｄＭｙｏＧ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣１２７８７￣５.[８]㊀ＷＥＩＤＷꎬＧＵＩＬＳꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬｅｔａｌ.ＮＲＦ１ａｎｄＺＳＣＡＮ１０ｂｉｎｄｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＳＩＸ１ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｂｏｄｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎＱｉｎｃｈｕａｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣０８３８４￣１.[９]㊀ＲＡＺＡＳＨＡꎬＫＡＳＴＥＲＮꎬＫＨＡＮＲꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏＲ￣ＮＡｓｉｎｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２０ꎬ１１(３).ＤＯＩ:１０.３３９０/ｇｅｎｅｓ１１０３０２９５.[１０]ＹＵＥＢＬꎬＬＩＨꎬＬＩＵＭꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ￣ｍｉＲ￣ＮＡ￣ｍＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋｔｏｒｅｖｅａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｅＲＮＡｓｉｎｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ１０.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｇｅｎｅ.２０１９.０００９１.[１１]ＦＵＹＹꎬＬＩＳꎬＴＯＮＧＨＬꎬｅｔａｌ.ＷＤＲ１３ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ￣ａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１９ꎬ４３(７):７９９￣８０８.[１２]ＬＩＡＮＬꎬＫＩＭＪꎬＯＫＡＺＡＷＡＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＹＡＰｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１０ꎬ２４(１１):１１０６￣１１１８. [１３]ＺＨＡＮＧＬꎬＹＵＥＴꎬＪＩＡＮＧＪ.Ｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｏｒｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].Ｆｌｙ(Ａｕｓｔｉｎ)ꎬ２００９ꎬ３(１):６８￣７３.[１４]ＹＩＪꎬＬＵＬꎬＹＡＮＧＥＲＫꎬｅｔａｌ.Ｌａｒｇｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｈｏｍｏｌｏｇｓ１ａｎｄ２ｒｅｇｕｌａｔｅｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍａｔｕ￣ｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｎｔａｇｏｎｉｓｍｏｆｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＹＡＰａｎｄＴＡＺ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ６４(５):１７５７￣１７７２.[１５]ＦＵＲＴＨＮꎬＡＹＬＯＮＹ.ＴｈｅＬＡＴＳ１ａｎｄＬＡＴＳ２ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ:ｂｅｙｏｎｄｔｈｅＨｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１７ꎬ２４(９):１４８８￣１５０１.[１６]姚春和ꎬ张荣.ｍｉＲ￣３７２靶向ＬＡＴＳ２对结肠癌ＳＷ６２０细胞增殖㊁迁移侵袭的影响[Ｊ].广西医科大学学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１０):１９０６￣１９１１.[１７]ＭＣＮＥＩＬＬＨꎬＲＥＧＩＮＥＮＳＩＡ.Ｌａｔｓ１/２ｒｅｇｕｌａｔｅＹａｐ/Ｔａｚｔｏｃｏｎｔｒｏｌｎｅｐｈｒｏｎｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２８(３):８５２￣８６１.[１８]冯瑞军ꎬ郑远航ꎬ盛智梅.外泌体ｍｉＲ￣５７４￣５Ｐ通过下调大肿瘤抑制基因２促进胶质瘤增殖㊁侵袭和迁移[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１１):１５２０￣１５２７.[１９]王利宏ꎬ王庆增ꎬ鲍建军ꎬ等.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ２基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４１(３):５１９￣５２５.[２０]鲍建军ꎬ苏㊀锐ꎬ王庆增ꎬ等.Ｓｍａｄｓ与Ｈｉｐｐｏ通道中ＹＡＰ１基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１６ꎬ４９(１１):２２０３￣２２１３.[２１]张玉龙.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ１基因对湖羊肌肉生长性状遗传调控的初步研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０１３.[２２]ＷＥＩＤꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬＷＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｉｓꎬｃｌｏｎｉｎｇꎬａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ１ｇｅｎｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ９.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｖｅｔｓ.２０２２.８５３８１９.[２３]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－әәＣｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２４]ＢＡＤＯＵＥＬＣꎬＭＣＮＥＩＬＬＨ.ＳｎａｐＳｈｏｔ:ｔｈｅｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ￣ｗａｙ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１１ꎬ１４５(３).ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｅｌｌ.２０１１.０４.００９. [２５]ＺＨＡＯＢꎬＴＵＭＡＮＥＮＧＫꎬＧＵＡＮＫＬ.Ｔｈｅｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙｉｎｏｒ￣ｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌꎬｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１３(８):８７７￣８８３.[２６]ＯᶄＨＡＹＲＥＭꎬＤＥＧＥＳＥＭＳꎬＧＵＴＫＩＮＤＪＳ.ＮｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏＧｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＧｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２７:１２６￣１３５.[２７]ＬＩＵＦꎬＷＡＮＧＸꎬＨＵＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｒｅｐｒｅｓｓｅｓｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｂｏｌｉｓｈｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ２８９(６):３３０８￣３３１６.[２８]ＡＭＢＲＯＳＩＮＯＣꎬＩＷＡＴＡＴꎬＳＣＡＦＯＧＬＩＯＣꎬｅｔａｌ.ＴＥＦ￣１ａｎｄＣ/ＥＢＰβａｒｅｍａｊｏｒｐ３８αＭＡＰＫ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎ０６７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬ２００６ꎬ３９６(１):１６３￣１７２.[２９]ＷＥＮＴꎬＬＩＵＪＨꎬＨＥＸＱꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２６(１２):２７９０￣２８０６.[３０]ＨＵＲＡＳＫＩＮＤꎬＥＩＢＥＲＮꎬＲＥＩＣＨＥＬＭꎬｅｔａｌ.Ｗｎｔ/β￣ｃａｔｅｎｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｖｉａＡｘｉｎ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄꎬｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＹＡＰ/ＴａｚａｎｄＴｅａｄ１ꎬａｃｔｉｖｅｉｎＩＩａ/ＩＩｘｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔꎬ２０１６ꎬ１４３(１７):３１２８￣３１４２.[３１]ＮＩＮＧＬꎬＮＥＬＳＯＮＢＲꎬＢＥＺＰＲＯＺＶＡＮＮＡＹＡＳꎬｅｔａｌ.Ｒｅｑｕｉｒｅ￣ｍｅｎｔｏｆＭＥＦ２ＡꎬＣꎬａｎｄＤｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１４ꎬ１１１(１１):４１０９￣４１１４.[３２]ＳＣＨＩＡＦＦＩＮＯＳꎬＤＹＡＲＫＡꎬＣＡＬＡＢＲＩＡＥ.ＳｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｔｈｅＭＲＦ４￣ＭＥＦ２ａｘｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＣａｒｅꎬ２０１８ꎬ２１(３):１６４￣１６７. [３３]ＴＡＹＬＯＲＭＶꎬＨＵＧＨＥＳＳＭ.Ｍｅｆ２ａｎｄｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:３３￣４４.[３４]ＶＡＬＬＥＪＯＡꎬＰＥＲＵＲＥＮＡＮꎬＧＵＲＵＣＥＡＧＡＥꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｎｔｅ￣ｇｒａｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈｕｎｖｅｉｌｓＦＯＳＬ１ａｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｅｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙｉｎＫＲＡＳ￣ｄｒｉｖｅｎｌｕｎｇａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａ￣ｔｉｏｎｓꎬ２０１７ꎬ８.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｎｃｏｍｍｓ１４２９４.[３５]ＺＡＭＭＩＴＰＳ.ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｏｇｅｎｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓＭｙｆ５ꎬＭｙｏＤꎬＭｙｏｇｅｎｉｎａｎｄＭＲＦ４ｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅꎬｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:１９￣３２.[３６]ＣＯＬＥＳＣＡꎬＷＡＤＥＳＯＮＪꎬＬＥＹＴＯＮＣＰꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｂｏｖｉｎｅｐｒｉｍａｒｙｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｔｏｌｉｖｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｃａｒｃａｓｅｗｅｉｇｈｔｉｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(４).ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒ￣ｎａｌ.ｐｏｎｅ.０１２４４６８.[３７]ＢＵＣＫＩＮＧＨＡＭＭꎬＲＩＧＢＹＰＷ.Ｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔａｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ２８(３):２２５￣２３８.[３８]ＸＵＤＱꎬＷＡＮＧＬꎬＪＩＡＮＧＺＺꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｗｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｔａｌｐｏｌｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｅｎｈａｎｃｉｎｇＭｙｏＤ/ＭｙｏＧ￣ｍｅｄｉａ￣ｔｅｄｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ２０９:３１３￣３２３. [３９]ＢＯＤＩＮＥＳＣꎬＬＡＴＲＥＳＥꎬＢＡＵＭＨＵＥＴＥＲＳꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ２９４(５５４７):１７０４￣１７０８.(责任编辑:陈海霞)１６７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析。
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1X PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1 MBS）,并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 >PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer （约每毫升沉淀加5ml 1 XPBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30〜60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min,取上清至一干净管中。
His 标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4C下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2 倍树脂体积的Binding/Wash Buffer 平衡柱子，以0.5〜1 ml/min 的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer 处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer 将His 标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit （No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE 分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M 尿素的缓冲液透析。
一、包涵体的纯化和复性总结(二)关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,内容比较庞杂。
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1。
高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等.2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动,即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50—100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10—15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用.4。
反复冻融法：将细胞在—20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取.这是标准配方:裂解液：50mM Tris—HCl(pH8.5~9.0)， 2mM EDTA, 100mM NaCl， 0.5% Triton X-100， 1mg/ml 溶菌酶。
收稿日期：2023-04-28基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31902348）作者简介：王瑞睿（1996—），女，布依族，硕士，研究方向为虾蟹性别决定与性别分化机制，E-mail：rrww28@广东农业科学2023，50（7）：156-163Guangdong Agricultural SciencesDOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.07.016王瑞睿，马克异. 罗氏沼虾Doublesex 基因的原核表达与蛋白纯化［J］. 广东农业科学，2023，50（7）：156-163.罗氏沼虾Doublesex 基因的原核表达与蛋白纯化王瑞睿1,2，马克异3（1. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2. 上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306；3. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）摘 要：【目的】Doublesex 属于DMRT 基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。
克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii ）Doublesex 基因（MrDsx ）的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾 M rDsx 基因的功能研究提供基础数据。
【方法】基于罗氏沼虾MrDsx 的开放阅读框序列，通过特异PCR 产物与表达载体pET-32a（+）连接，获得重组质粒 p ET-32a-MrDsx ，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，构建罗氏沼虾MrDsx 基因的原核表达细胞。
利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性转化细胞进行诱导表达，并以SDS-PAGE 电泳，Western blot 和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。
【结果】以罗氏沼虾性腺cDNA 为模板，利用MrDsx 基因的特异引物，PCR 扩增获得了约660 bp 大小的单一DNA 条带。
