秦宗会’‘谭蓉,蒲利军“江虹‘
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第34卷2006年3月分析化学(FENXI HUAXUE)研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期403-406
刚果红褪色光度法测定盐酸西布曲明及作用机理研究秦宗会’‘谭蓉,蒲利军“江虹‘(涪陵师范学院化学及环境科学系,重庆408003) z(太极集团涪陵制药厂,重庆408000)
摘要在弱酸性NaH, P04 -Na, HPO;的缓冲介质中,盐酸西布曲明与刚果红染料反应,形成离子缔合物,溶 液颜色发生明显改变,褪色波长在342 nm,490nm,其中最大褪色波长在490 nm,从而建立了测定盐酸西布曲 明的光度法。在最大褪色波长处,盐酸西布曲明的浓度在0.35一3. 2 x 10 -s mol/L范围内遵守比尔定律;表观 摩尔吸光系数E40为1.67 x 104 L " mol -' " 'cm -';检出限为4.45 x 10-7 mol/L。方法具有较高的灵敏度和良 好的选择性,用于曲美胶囊中盐酸西布曲明的测定,结果满意。本实验还用密度泛函理论对反应机理进行了 探讨,结果与实验结果相符合。
关键词分光光度法,盐酸西布曲明,刚果红,反应机理,密度泛函理论1引、言 对肥胖症的治疗,人们普遍推崇控制饮食和加强运动治疗,但在饮食和运动治疗效果不佳时需应用药物治疗。盐酸西布曲明(sibutramine hydrochloride)化学名:(1 ) 1-(4-氯苯基)一,N-二甲基一。一(2一甲基丙基卜环丁基甲胺盐酸盐单水合物(德国Knol公司研制),该药于1997年获美国FDA批准在美国上市;2000年获国家药品监督管理局(SDA)批准在中国上市,用于治疗肥胖症〔’〕。是一种安全有效的减肥药。 据文献报道盐酸西布曲明的分析方法有液相色谱法[2-41、毛细管电泳法[[5l和LC-MS法[[61等,关于光度法的文章未见报道。分光光度法因操作简便、快速、仪器价廉而被广泛采用。实验观察到,在弱酸性介质中,盐酸西布曲明以大阳离子状态存在,刚果红以大阴离子存在,通过静电作用和疏水作用,形成・离子缔合物,使溶液颜色发生明显改变。褪色波长在342和490 run。其中最大褪色波长在490 nm,在最大褪色波长处,盐酸西布曲明的浓度在(0.35一3. 2) x 10 -5 mol/L范围内遵守比尔定律,从而建立测定盐酸西布曲明的光度法。线性方程为A = 0. 1726 x 105 C - 0. 0571,相关系数;= 0. 9987;表观摩尔吸光系数e.为1.67 x 104 1r (mol . CM)检出限为4.45 x 10 -7 mol/L。本实验还对该体系的吸收光谱特征,适宜的反应条件,缔合比及干扰物的影响进行了研究。该法简便,具有较高的灵敏度和良好的选择性,用于曲美胶囊中盐酸西布曲明的测定,结果满意。本研究还用量子化学的密度泛函理论对反应机理进行了探讨。
2实验部分2.1仪器及试剂 U-4100紫外一近红外分光光度计(日本日立公司);722型光栅分光光度计(四川仪表九厂);H19024型酸度计(HANNA) ;AR2140电子天平(OHAUS )。 盐酸西布曲明(SH,纯度99.5%以上,山东临沂康康生物技术有限公司)标准溶液:1. 0 x 10 -4mol/L的水溶液;刚果红(CR,上海试剂三厂)溶液:1.0 x 10-4 mol/L的水溶液;NaH2 P04-Na2 HP04缓冲溶液:0. 2 mol/L的NaH,P04与0. 2 mol/L Nat HP04以不同比例配成不同pH值的缓冲液。其它试剂为分析纯,分析用水为二次蒸馏水。2.2实验方法 在10 mL比色管中,依次加人pH =6.5的NaH2 P04-Na2 HP04缓冲溶液1.0 mL,适量盐酸西布曲明
2005-05-31收稿;2005-07-11接受分析化学第34卷溶液及刚果红溶液2.0 mL,用二次蒸馏水稀释至刻度,摇匀,静置20 h。将试液置于1 Cm比色皿中,在最大吸收波长490 nm处,以试剂空白为参比测定吸光度。
3结果与讨论
SH-CR溶液(以试剂为参比)在,以水为参比时,盐酸西布曲明在0000,诊
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3.1吸收光谱 分别对SH标准溶液、CR溶液、SH-CR溶液(以水为参比)及300 -600 nm的波长范围内进行扫描得吸收光谱如图1。由图1可知300 - 600 nm波长范围内不吸收,刚果红在488,338 nm处有吸收峰存在,形成离子缔合物后溶液颜色减褪,在488,338 nm处有吸收峰,此峰明显低于纯染料的吸收峰;当以试剂为参比时,在342,490 nm处形成较大的波谷,其中在490 nun处波谷最大,灵敏度最高。故本实验选择可见光区最大褪色波长490 nm作为测定波长。3.2适宜的反应条件3.2.1试剂CR用量影响实验了CR(1. 0 x 10-4 moVL)溶液用量对体系褪色程度的影响。结果表明,CR用量小于1.9 mL时,吸光度随CR的增大而增大;在1.9 -4.0 mL范围内,吸光度基本不变;当CR用量超过4.0 mL时吸光度反而降低。染料用量小时,SH作用不完全;染料用量过大,空白值增大,误差相应增大。故实验选择CR用量为2. 0 mLo3.2.2 pH值影响由于CR是酸碱指示剂,pH变色范围在3.0-5.0,本身颜色变为蓝紫色到红色。本研究实验了pH 1.0一3.0的
图1刚果红一盐酸西布曲明体系的吸收光谱Fig. 1 Absorption spectra of Congored-sibutramine hydrochloride(CR-SH) system1. CR; 2. CR-SH; 3. SH(水为参比against water) ; 4. CR-SH(试剂为参比against reagent blank)
HCl-NaAC缓冲体系,褪色现象不明显,说明该pH值范围不是最佳缔合环境;对pH 5. 5一7. 8的NaH, P0, -Na, HPO;缓冲体系进行了研究,结果表明,pH在6.0一7.25时吸光度最大且稳定,其中pH6.5时灵敏度最高。pH过高,不利于SH的N原子质子化;pH过低,促使CR分子中的磺酸基结合H十,都不利于缔合物的生成,吸光度均降低。在缓冲液pH 6.5时,用量在0.9一1.5 mL吸光度最大。故实验选择pH 6.5的缓冲溶液1.0 mLo3.2.3表面活性剂的影响实验了某些非离子型、阳离子型、阴离子型表面活性剂对体系的影响。实验表明,非离子型对体系吸光度没有增敏作用;某些阴离子型如十二烷基苯磺酸钠对试剂没有影响,但能封闭试样(SH),阻碍SH与CR的反应,使体系不褪色;而以钱盐为代表的阳离子型表面活性剂能使试剂明显褪色,对体系影响较大,测定的灵敏度大大降低。3.2.4加样顺序与体系稳定性试剂加人顺序对吸光度有少量影响。其中以CR-.SH*缓冲液吸光度变化相对较小,以缓冲液*SH-.CR顺序吸光度变化相对较大。而在试剂加人后,测定不同时间的吸光度,刚开始,吸光度随时间延长而逐渐增大,当放置18h时吸光度达稳定,直到40 h吸光度基本不变。本实验用加热、增加表面活性剂等都不能缩短反应完全的时间。故本实验选择以缓冲液*SH-.CR的加人顺序,放置20 h测定。3.3离子缔合物组成 在pH 6.5的介质中,盐酸西布曲明以阳离子状态存在,刚果红则以大阴离子状态存在,通过静电引力、疏水作用形成离子缔合物。以摩尔比法和等摩尔连续变化法测定了离子缔合物的组成,结果为n(SH):n(CR) =2:1,即离子缔合物的组成为CR・(SH)zo 采用量子化学的密度泛函理论(DFT)的B3LYP方法,在G03上用6-31G基组对CR,SH的基态电荷密度分布、偶极矩、轨道能量进行了计算。由CR的电荷密度分布可知:正电荷密度分布在磺酸基上的S原子最大,两个S分别为1.299,1.223,其他原子电荷密度分布较均匀,主要吸引负电荷密度的为S原子;而SH的电荷密度分布中,N原子负电荷密度分布为一0.442,是整个原子中负电荷密度分布最大的,其他原子不显著。两者混合后,电荷将重新分布,使体系的能量降低。从Debye总偶极矩看:CR的第3期秦宗会等:刚果红褪色光度法测定盐酸西布曲明及作用机理研究总偶极矩为5.9133 Debye,SH的总偶极矩为2.5960 Debye,说明两个分析结构不对称,有极性存在。从最高占据轨道和最低空轨道能量看:CR分子最高占据的轨道能量一0.5110 kJ/mol,最低空轨道能量-0.2446 kJ/mol,CH分子最高占据轨道能量一0.5247 kJ/mol,最低空轨道能量一0.0280 kJ/mol,最高空轨道的能量与最低占据轨道的能量相差较小,使得电子跃迁成为可能,容易生成配位键。由此推断,CR分子中的两个S原子能结合SH分子中的N原子,这样一个CR就能结合两个SH,与实验事实相符。因此形成离子缔合物不仅借助于静电作用和疏水作用,也发生了电荷转移作用,形成的缔合物可能的分子式如下。
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-l- N二N -\\ /一\ //-N=N
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3.4标准曲线 在实验选定最佳条件下,取不同浓度的盐酸西布曲明与刚果红溶液混合,在选定波长处以试剂空白为参比测定吸光度,以吸光度对SH浓度作图,绘制标准曲线。结果表明;SH浓度在(0.35一3. 2) x10 -5 mol/L范围内遵守比尔定律;线性方程为A = 0. 1726 x 10'C - 0. 0571,相关系数r = 0. 9987;表观摩尔吸光系数-'490为1.67 x 100 L " mol -' " cm -' , 11次空白实验测得其标准偏差,为0.0089;检出限为4.45 x 10一7mot/Lo表1某些分析法灵敏度的比较Table 1 Comparison of the sensitivities with some methods
方法Method试剂Reagent 检出限Detection limit线性范围Linear range 文献Reference
,..
一
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.J
67r
esJ
Les
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High performhromatography( 甲醇一水一三乙胺
Methanol-Hz O-triethylamine
High performance liquidchromatography(HPLC)甲醇Methanol
KH2P04 pH 3.0