细菌基因组DNA的提取ppt课件

二、实验原理
核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： (1)应保证核酸一级结构的完整性 (2)排除其他分子的污染
核酸纯化应达到的要求： (1)核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子： (2)其他生物大分子的污染应降低到最低程度 (3)排除其他核酸分子的污染
三、核酸制备的步骤
破碎细胞
提取 纯化
裂解液的制备 将DNA结合 加入漂洗液 加入洗脱
到吸附柱上
缓冲液
获得DNA 溶液
四、实验步骤
（1）取细菌培养液 1ml，10000r/min离心1min，尽量吸净上清。 （2）向菌体沉向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。 （4）加入220μl缓冲溶液GB,振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心去除管盖内壁的水珠。 （5）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 （6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离 心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲溶液GD（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心 30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （8）向吸附柱CB3中加入600μl 漂洗液PW（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心30s， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （9）重复操作步骤8。 （10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μlTE,室温放置 2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性 Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
二、材料、设备及试剂
菌种 ：大肠杆菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37℃ 、60 ℃ ） 试剂：LB液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂 盒。
三、操作步骤
四、注意事项——材料准备
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
实验一、细菌基因组DNA的提取
一、实验原理
1、核酸的分类
DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。

（一）细菌基因组DNA的提取1.试剂1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。

2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。

2.操作步骤：1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。

2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。

3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。

4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。

5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。

6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。

7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。

如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。

（二）细胞基因组DNA的提取Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C.（三）Chelex法抽提DNA1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。

去 上 清 液
5.
保存
10000 r/min 离心10分钟
注意事项
➢ 在整个实验过程中应严格执行无菌操作； ➢ 部分药品有毒，操作中应注意安全防护； ➢ 磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低
温状态 。 ➢ 刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要
轻柔！ ➢ 抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免
实验二植物基因组DNA的提取
背景知识
植物细胞中有哪些细胞器中含有DNA？ 与动物细胞的差别？
背景知识
DNA的存在形式
背景知识
DNA的存在形式
背景知识
DNA的存在形式
核苷酸 双螺旋结构
+组蛋白 一级结构-核小体
二级机构-螺线管
三级结构-超螺旋管
四级机构-染色体
背景知识
DNA的存在形式
DNA的理化性质
实
验
离心机：3台/12管 水浴锅：65℃
仪 研钵：10个
器 移液枪（包括枪头）
实 新鲜菠菜叶片
验 材
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、三羟甲基氨基 甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、 氯化钠、Tris饱和酚、异丙醇、β-巯基乙醇、
料 无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯
无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)
1ml酚-氯仿-异戊醇
5mol/l EDTA
8ml
1ml酚-氯仿-异戊醇
酚1m:氯l酚仿-氯:异仿戊-异醇戊=注2醇5:2意4:1：4此0ml方法会把少量RNA提取出来，故后面通称核酸的提取。
取20ml前面配制的氯仿-异戊醇+20mlTris饱和酚