收稿日期：2013-02-03基金项目：沈阳市大型仪器共享项目（２００７ＧＸ－０２）作者简介：朱赫（１９８７－），女，沈阳农业大学博士研究生，从事农药学研究。通讯作者：纪明山（１９６６－），男，沈阳农业大学教授，博士，从事农药学研究。沈阳农业大学学报（社会科学版），2013－03，15(2)：129-133
JournalofShenyangAgriculturalUniversity（SocialSciencesEdition），2013－03，15(2)：129-133
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９７１３．２０１３．０２．００１
农药残留快速检测生物传感器研究进展
朱赫，纪明山
（沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳１１０１６１）
摘要：迄今为止，农药残留快速检测用途生物传感器主要有酶生物传感器和免疫生物传感器两大类，农药残留快速检测用途酶生物传感器又包括胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基转移酶等七种类型，主要用于蔬菜、水果，以及食品中农药残留的快速检测。农药残留快速检测用途免疫生物传感器主要包括电化学、光学、压电和微机械悬臂梁四种类型，可以直接用于饮用水、果汁和葡萄酒等农药残留快速检测。关键词：农药残留；快速检测；生物传感器；酶生物传感器；免疫生物传感器中图分类号：Ｓ４８１．８；ＴＰ２１２．３文献标志码：Ａ文章编号：１００８－９７１３（２０１３）０２－０１２９－０５
一、生物传感器问题的提出
目前，中国食品安全已被空前地提到国家重视的高度，果蔬和肉禽等大宗农产品或食品快速检测技术成
为衡量和监管食品安全的关键手段和措施。伴随科学技术的发展，生物酶、抗原抗体、全细胞、基因等生物活性
物质均可用于生物传感器中生物分子识别元件制作，但用于食品中农药残留快速检测用途的生物传感器主要
有酶生物传感器和免疫生物传感器两大类型，而包括微生物、动植物组织等全细胞生物传感器和基因生物传
感器在农药检测方面应用研究很少。而且，全细胞生物传感器在农药检测方面的应用研究主要针对水资源污
染监控［１］，基因生物传感器在农药检测方面应用研究主要针对农药引起的ＤＮＡ损伤检查［２］，两者在食品中农药
残留快速检测上应用尚属空白，因此，就用于农药残留快速检测用途的酶生物传感器和免疫生物传感器的研
究进展和应用情况做较详细的综述，旨在为农业领域生物传感器未来应用和发展提供一个清晰的研究背景。
二、酶生物传感器发展概况
迄今为止，已有胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基
转移酶等七种活性酶被用于制作酶生物传感器，进行农药残留快速检测。其中前五种酶制作的酶生物传感器
是测量酶抑制作用，而后两种是酶制作的酶生物传感器，直接测量酶促反应中所涉及的化合物。（一）胆碱酯酶生物传感器
胆碱酯酶生物传感器是最早开发并且得到最广泛使用的酶生物传感器，主要用于有机磷和氨基甲酸酯类
农药残留快速检测。从分子识别元件上的敏感材料角度，可分为单酶、双酶和三酶共三种类型。从信号转换元
件角度，主要有电位型、电流型、离子选择性场效应管型、光学型、压电型等多种类型。
1.单酶型胆碱酯酶生物传感器乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）和丁酰胆碱酯酶（ＢｕＣｈＥ）常用底物乙酰胆碱或丁酰胆碱水解时都能电离出Ｈ＋，使溶液ｐＨ值发生变化，该变化值与消耗的活性物质浓度对数成正比，检测ｐＨ便
可得待测物质的浓度。因此，可利用电化学方法，如电位测定法来检测，常用玻璃ｐＨ电极或对溶液ｐＨ值变化
敏感的金属氧化物电极作基底电极，通过检测ｐＨ值变化来间接测定有机磷农药，其中，ｐＨ玻璃电极最简单、
廉价［３］。使用人造底物硫代乙酰（丁酰）胆碱代替乙酰（丁酰）胆碱，这两种人造底物酶促水解生成的电活性硫代胆
碱可以在Ｐｔ、玻碳等阳电极表面氧化，可设计成电流型酶电极。对Ｈ＋敏感的离子选择性场效应管（ＩＳＦＥＴ）也是
制备胆碱酯酶生物传感器时常采用的信号转换器。它比玻璃电极检测灵敏度高，检测限可达１０－６ｍｏｌ／Ｌ［４］，响应沈阳农业大学学报（社会科学版）第15卷
速度快且不会随电极寿命而改变。光学胆碱酯酶生物传感器主要如下原理构建：在ＡＣｈＥ水解底物乙酰胆碱过
程中，生成的乙酸引起溶液ｐＨ降低，可引起溴甲酚紫、氯酚红等ｐＨ指示剂的颜色变化［５］；ＣｈＥ抑制剂可引起竞
争性抑制剂单磺酸基四苯基卟啉（ＴＰＰＳ１）与ＡＣｈＥ复合物的吸收光谱发生变化，即在４１２ｎｍ处吸光度降低［６］；
ＡＣｈＥ催化乙酰巯基胆碱水解产物巯基胆碱可作为半导体材料价带空穴的电子施主，在ＡＣｈＥ抑制剂存在情
况下，ＡＣｈＥ催化活性受到抑制，水解产物巯基胆碱量降低，引起光电流减小［７］。压电胆碱酯酶传感器是将ＡＣｈＥ
固定在石英微天平晶体表面制成。石英晶体微天平（ＱＣＭ）传感器是质量敏感装置，能够测量极小的质量变化。
2.多酶型胆碱酯酶生物传感器胆碱酯酶生物传感器除单酶系统外，还有双酶和三酶系统。双酶生物传感
器是将ＣｈＥ与胆碱氧化酶（ＣｈＯＤ）耦合。ＡＣｈＥ水解其天然底物生成胆碱和乙酸，由于胆碱没有电化学活性，使
用ＣｈＯＤ将胆碱氧化，消耗氧而生成Ｈ２Ｏ２，可用电流型酶电极测定溶液中消耗的Ｏ２或生成的Ｈ２Ｏ２来检测有机
磷农药。这种电流型双酶生物传感器检测限为３×１０－１８ｇ·Ｌ－１［８］。或者将ＡＣｈＥ与酪氨酸酶耦合构建双酶生物传感
器［９］，对氧磷和毒死蜱的检测限分别为５．２×１０－６ｇ·Ｌ－１和０．５６×１０－６ｇ·Ｌ－１。Ｃｈｏｉ等则利用ＡＣｈＥ催化邻硝基苯乙
酸水解生成黄色的邻硝基苯酚，以及谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）催化谷胱甘肽（ＧＳＨ）和１-氯-２，４-二硝基苯（ＣＤＮＢ）生
成２，４-二硝基苯谷胱甘肽的反应，将ＧＳＴ和ＡＣｈＥ共同固定在胶膜上，可同时测定有机磷和硫醇类农药［１０］。三
酶生物传感器则是将过氧化物酶添加到ＡＣｈＥ与酪氨酸酶耦合的双酶系统中制成。Ｋａｒｏｕｓｏｓ等使用这种三酶
石英晶体微天平（ＱＣＭ）酶生物传感器用于测定有机磷和氨基甲酸酯类农药［１１］。
（二）有机磷水解酶生物传感器
有机磷水解酶生物传感器检测原理是：有机磷水解酶（ＯＰＨ）能催化有机磷农药中Ｐ－Ｏ、Ｐ－Ｓ和Ｐ－ＣＮ键水
解生成酸和醇，这些水解产物通常是电活性或光活性物质，可以被转换成可测量的电或光信号，实现有机磷测
定。有机磷水解酶生物传感器主要有电位、电流、电位－电流、离子选择性场效应管（ＩＳＦＥＴ）、光学等多种类型。
起初的研究将ＯＰＨ直接交联在玻璃电极表面制成简单的电位型生物传感器［１２］，对二嗪农、对氧磷、对硫磷和甲
基对硫磷的检测限为２．０×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１，其中检测对氧磷的灵敏度最高。电流型生物传感器基于ＯＰＨ水解对硫
磷、对氧磷等生成的电活性对硝基酚（ＰＮＰ）在阳极氧化形成电流来测量酶促反应的速率。Ｓｃｈ觟ｎｉｎｇ等将ＯＰＨ通
过胱胺／戊二醛交联技术固定在微制作金电极和具有场效应的结构板上，前者作为电流响应电极，后者作为电
位响应电极；再将电极与流动注射分析系统相连，开发出一种电位-电流型ＯＰＨ生物传感器［１３］，可区别对氧磷、
对硫磷、敌敌畏和二嗪农的检测，且检测浓度都在１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１级。Ｆｌｏｕｎｄｅｒｓ等将ＯＰＨ和氨丙基三乙氧基硅烷
（ＡＰＴＳ）通过戊二醛共价交联在溶胶凝胶修饰的以Ｓｉ２Ｎ４为敏感层的栅极上，制成ＩＳＦＥＴ型酶生物传感器［１４］，采
用差分电路来实现整个检测过程，在小于１０ｓ的响应时间内，能检测到低达１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１的对氧磷。光学ＯＰＨ
生物传感器则是将异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）、半萘基荧光素（ＳＮＡＦＬ）等荧光物质与ＯＰＨ共价固定在聚乙二醇水凝
胶上制成光学敏感元件，采用荧光光谱测定法检测有机磷浓度。
（三）磷酸酶、酪氨酸酶生物传感器
磷酸酶生物传感器分为碱性磷酸酶生物传感器和酸性磷酸酶生物传感器两类。碱性磷酸酶（ＡＬＰ）除催化底
物磷酸单酯水解成乙醇和磷酸盐外，还会受到各种不同化合物的抑制。利用不同酶底物开发检测农药的ＡＬＰ
生物传感器。如根据测量ＡＬＰ催化化学发光底物去磷酸化所产生的光强度，开发出化学发光ＡＬＰ生物传感
器，用于检测对氧磷［１５］；利用ＡＬＰ催化１-萘基磷酸酯水解成荧光１-萘酚，开发出荧光ＡＬＰ生物传感器，用于检
测有机氯、农药（氨基甲酸酯和杀螟松）、重金属和ＣＮ－［１６］；利用３-吲哚酰磷酸酯、磷酸苯酯或维生素Ｃ-２-磷酸酯
作酶底物，开发出电化学ＡＬＰ生物传感器，用于检测马拉硫磷和２，４－Ｄ［１７］。而酸性磷酸酶生物传感器依据有些
农药能可逆地抑制酸性磷酸酶（ＡＰ）。将ＡＰ和葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）偶联到商品Ｈ２Ｏ２感测电极上，可开发出一种
双酶生物传感器［１８］，用于电化学检测马拉硫磷、甲基对硫磷和对氧磷。有机磷和氨基甲酸酯类农药以及莠去津
等各种不同化合物都能抑制酪氨酸酶。依据酪氨酸酶活性抑制作用原理制成的电化学生物传感器主要有电流［１９］和
方波伏安（ＳＷＶ）［２０］两种类型。因为受到许多底物和抑制剂干扰，酪氨酸酶生物传感器特异性较差。（四）过氧化物酶、谷胱甘肽巯基转移酶生物传感器
将辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）共价结合在金电极上，开发出一种基于过氧化物酶抑制原理的生物传感器［２１］，用130··第2期朱赫等：农药残留快速检测生物传感器研究进展
于检测氨基甲酸酯类农药硫双灭多威。使用谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ），开发出一种光纤生物传感器［２２］，用于检
测莠去津。采取交联法将该酶固定化到膜上，利用中间粘合剂溶胶－凝胶层将该膜涂装在内玻璃盘上。将溴甲
酚绿混入溶胶－凝胶中作为ｐＨ指示剂。ＧＳＴ催化谷胱甘肽（ＧＳＨ）对莠去津的亲核试剂进攻，释放出Ｈ＋。利用溴
甲酚绿的颜色变化，光学测量这种ｐＨ变化。
三、免疫生物传感器发展概况
免疫生物传感器工作原理的核心是抗原-抗体间的特异性分子识别机制，即固定在信号转换元件(换能器)
表面的抗体(Ab)或抗原(Ag)可以识别并结合与之相对应的特定分析物中的Ag或Ab。再利用合适的信号转换方
法，将抗原-抗体反应所产生的生物学信息变化转化为合适的测量参数，从而构成相应的免疫生物传感器。目
前，农药检测用途的免疫生物传感器主要有电化学、光学、压电和微机械悬臂梁几种类型，可以直接用于饮用
水、果汁和葡萄酒等饮品中农药残留快速检测。
（一）电化学免疫生物传感器
电化学免疫生物传感器可分为电流、电导、电压和阻抗滴定等几种类型。Grennan等用导电聚苯胺(PANI)/
聚乙烯基磺酸(PVS)共聚物修饰的固体聚合物(SPE)碳糊电极，开发出一种安培免疫传感器[23]，用于检测莠去津。
Mosiello等开发出一种电位生物传感器，用于检测农业广泛使用的除草剂特丁津(TBA)[24]。Valera研究小组将电
导型免疫生物传感器用于红葡萄酒中莠去津检测，[24]采取吸附法[26]或共价键合法[27]，将莠去津-牛血清白蛋白
(BSA)偶联物固定在IDμE表面上，利用竞争性免疫开发出阻抗滴定型生物传感器，用于检测莠去津，检出限为
1.9×10-10g·moL-1。最近Ionescu等将用组氨酸标签修饰的抗莠去津抗体固定到由金电极上电生的氨三乙酸
(NTA)N-取代的聚吡咯(PPy)膜上[28]，开发出一种检测莠去津的阻抗滴定免疫传感器，检出限为4.6×10-11g·moL-1。
（二）光学免疫生物传感器
光学免疫传感器主要有表面等离子体共振(SPR)、荧光偏振、全内反射荧光(TIRF)、偏振调制红外反射吸收
光谱(PM-IRRAS)几种类型。Mauriz等使用商品SPR开发出SPR免疫生物传感器，用于实际水样中农药的在线
监测[29]。他们采取自组装单层(SAM)法，将农药-牛血清白蛋白(BSA)偶联物固定化在金电极上，获得可重复使用
超过200次检测的敏感表面。他们还将几种偶联物固定化在流动池的敏感表面上，可同时检测DTT、毒死蜱和
西维因。Miura研究小组开发出一种SPR免疫传感器[30]，用于2,4-D的竞争检测。要开发荧光偏振免疫生物传
感器，必须将免疫物种与荧光标记进行偶联。然而，荧光有机染料遭受光致褪色问题困扰。可用纳米颗粒作为
荧光受体解决这个问题。为此，铕螯合物染色聚苯乙烯纳米颗粒已被用来开发用于检测莠去津的免疫传感器[31]。
Barzen等研制出一种带有流动注射系统的便携式TIRF免疫生物传感器原机，用来监测地表水质量[32]。Pradier
研究小组利用间接竞争格式，开发出检测环境污染物莠去津的偏振调制红外反射吸收光谱(PM-IRRAS)免疫传
感器[33]。
（三）压电、微机械悬臂梁免疫生物传感器
2009年，March等开发出一种QCM免疫传感器[34]，用于果汁中西维因和3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)的检测
分析，西维因和TCP分别是杀虫剂毒死蜱和除草剂绿草萣的主要代谢物，通过自组装单分子膜(SAM)将半抗原
偶联物固定化在金电极上。这种共价固定允许修饰电极表面可重复使用至少150次检测，而敏感性没有太大
损失。Suri等将巯基化莠去津抗体固定在镀金悬臂梁上，开发出一种超灵敏的微悬臂梁免疫传感器，用于检测
莠去津，莠去津结合到固定化抗体(Ab)改变了悬臂梁弯曲引起的表面应力变化[35]，检出限为1.0×10-11g·moL-1。
最近，还开发出一种悬臂梁竞争免性疫传感器[36]，用于欧洲地下中水农药残留2,6-二氯苯甲酰胺(BAM)的检测。
四、生物传感器未来发展
２１世纪，世界各国将更加重视农药检测用途生物传感器的研究和开发，除了可使用酶、抗体（抗原）、全细胞
（微生物或组织）、ＤＮＡ可作为生物传感器的识别元件之外，分子印迹聚合物（ＭＩＰ）和寡核苷酸适配子也会陆续被用作农药检测用途生物传感器的识别元件。ＭＩＰ由于具有与天然抗体同样的识别性能和与高分子同样的抗腐131··
