小球藻固定化培养的初步研究

植物细胞固定化预实验实验目的：熟悉海藻酸钠做固定剂下植物细胞固定化培养试验操作。

实验材料：悬浮培养的植物细胞种子、250ml三角瓶5个、培养皿、移液枪、电子称、电磁搅拌器、滴管或注射器、烧杯、纱布、漏斗、铁架台。

实验步骤1.实验准备：配制植物细胞液体培养基分装到4个250ml三角瓶中，每瓶70ml；溶液；配制40g/L的海藻酸钠溶液100ml并称量配制好配制一定量20g/LCaCl2。

的海藻酸钠溶液质量w12.灭菌3.制备凝胶球3.1取种子液用两层无菌纱布过滤，收集滤液。

3.2静置滤液，用移液枪移去上层培养液至于事先准备好的无菌三角瓶中备用。

获得植物细胞。

3.3取鲜重20g的细胞于配置好的无菌还在酸钠溶液中边加入边用电磁搅拌器搅拌。

溶液中形成直径3.4用滴管或注射器吸取海藻酸钠--细胞混合液滴入无菌CaCl2溶液，用无菌水充分洗涤凝胶珠。

3--5mm的凝胶球，放置30--60min后倒出CaCl2）/20g加入到含70ml新鲜培养基+10ml原培养基3.5称量胶球质量w=8*（20+w1的三角瓶中，制作两瓶。

称量植物细胞鲜重8g加入到含70ml新鲜培养基+10ml 原培养基中做对照。

4.在一定条件下进行摇瓶振荡培养，每5天取发酵液测定培养基组分消耗情况、代谢产物的生成速率等并观察记录胶球完整情况。

植物细胞固定化培养原理及海藻酸钠浓度单因素试验方案科学研究发现，密集而有一定程度分化的、生长缓慢的细胞培养物，较分散而无结构的、生长迅速的细胞培养物累积更多的次生代谢物。

其原因为:前者细胞所处的理化环境与其在整体植物中所处的环境类似，细胞因而能够发挥正常的代谢功能；而对后者而言，细胞在培养液中所处的环境既无极性，也无理化梯度。

故而设想把细胞固定在一定的支持物上，使它们之间密切接触，并形成一定的理化梯度。

如此，既可以保障细胞的营养需要，又可避免由于代谢产物的累积而对细胞代谢造成反馈抑制。

物质生产大多利用处于稳定增殖期的细胞，由于固定化抑制生长发育，因此应考虑尽可能模拟稳定期等等。

小球藻的培养一、小球藻小球藻是单细胞植物，种类较多，多数生活在淡水中，少数生活在海洋里。

按植物学分类，小球藻属于小球藻纲绿藻目原球藻科生物，其体型小，直径一般为3～5μm，在显微镜下，需要放大400～600倍才能看到，我们肉眼看到的只不过是含有小球藻的绿色的水。

小球藻所含的营养成分很高，其蛋白质含量达到50%～60%（相当于花生米的2倍、鸡蛋的5倍），含脂肪10%～30%，还含有多种维生素。

小球藻的生物活性物质糖蛋白和多糖体的含量也相当高，这些生物活性物质具有增强人体免疫力、抗癌、降血压、抑制血糖上升、排除体内毒素和迅速恢复机体损伤等功能。

因此，小球藻的培养前景广阔。

作为培养原料的小球藻，可以到较清洁的池塘、水坑中采集绿色的水，在显微镜下鉴定，然后再用。

也可以向培养它的人索取。

1 容器的准备小规模的培养可用瓶、缸等，大规模的培养可用水泥池。

首先，要对所使用的容器进行消毒，一般用100mg/L的漂白粉水溶液浸泡，再用水冲刷数次。

(100mg/L的漂白粉水溶液的配制：①天平称量5g2%漂白粉澄清液；②定量转移至容量瓶中；③加水至1L；④混匀。

2％漂白粉上清液的配制法：取漂白粉2克，加少量水搅匀，再加水至100毫升，充分调匀后，待澄清后取上清液使用。

）2 培养液的准备（1）BG11液体培养基配方：Stock1 定容100mL 柠檬酸0.3g 柠檬酸铁胺0.3g EDTANa2 0.05gStock2 定容1000mL NaNO3 30g K2HPO4 0.78g MgSO4·7H2O 1.5gStock3 定容100mL CaCl2·2H2O 1.9g Stock4 定容100mL Na2CO3 2gStock5 定容1000mL H3BO3 2.86g MnCl2·4H2O 1.81g ZnSO4·7H2O 0.222gNa2MnO4·2H2O 0.391g CuSO4·5H2O 0.079g Co(NO3)2·6H2O 0.049gStock1 取用2mL Stock2 取用20mL Stock3 取用2mL Stock4 取用1mL Stock5 取用1mL 总定容1000mL（2）购买2000元/套，九种原液各200ml（稀释1000倍），10瓶。

小球藻的培养技术及培养流程小球藻可在自养条件下利用光能和二氧化碳进行正常的自养生长, 也可在异养培养条件下利用有机碳源进行生长和繁殖。

目前其培养方式主要包括开放式培养和封闭式培养。

开放式培养在敞开容器中进行, 一般用水泥池,CO2 可以采用人工供给或依靠与空气的自然交换, 并通过人工搅拌使空气中的CO2 溶解的方法来补充。

但开放式培养存在一些不易克服的缺陷: 首先是不可避免地受到自然条件(如阳光、温度等)的影响和限制, 产量、质量难以维持稳定; 其次是易受到异种生物的污染甚至取食,引起培养藻液的退化甚至培养失败。

封闭式培养主要有密闭发酵罐和玻璃管道光合生物反应器培养, 离心式水泵搅拌或气升式搅拌, 补加无机营养液或有机营养液及CO2, 产量约为开放式培养的10倍。

用管道光合反应器大规模培养小球藻的工艺流程如图所示。

虽然封闭式培养设备成本高, 但便于控制, 能抗污染, 可提高产率,生物系统的稳定性好, 质量和产量也较稳定。

小球藻培养既可利用自然光, 也可人工光照, 最适光强为2000～5000lux, 温度25～30℃, pH615～715, 主要使用无机营养液进行培养, 也可在培养基中加入果糖、乙酸、甘油、半乳糖、葡萄糖等物质, 使其变成异养生长。

营养液配方根据产品的目的不同而不同, 作为人类健康食品和医药制品为目的的产品, 无机营养液要求用分析纯的化学试剂配制; 作为饲料添加剂为目的的产品, 可以使用化学肥料, 补充微量元素。

小球藻同其他微生物相比, 藻产物较稀, 因此收获中需采取有效的脱水步骤。

过去小球藻细胞的收获常采用凝结法、絮凝法、沉淀法、过滤法等等, 但这些方法严重影响产品的质量, 目前主要采用离心法收获小球藻, 滤液有时还可以循环使用。

该方法很有效, 但需要较高的投资和耗能。

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1. 配方：小球藻培养基的配方可以根据不同的需求进行调整，以下是一种常用的配方：硝酸钠（NaNO3），1.5g/L.磷酸二氢钾（KH2PO4），0.04g/L.硫酸镁（MgSO4·7H2O），0.075g/L.氯化钙（CaCl2·2H2O），0.025g/L.碳酸钠（Na2CO3），0.02g/L.柠檬酸铁铵（FeC6H5O7·NH4OH），0.005g/L.微量元素溶液，1ml/L.2. 微量元素溶液配方：硼酸（H3BO3），2.86g/L.氯化锰（MnCl2·4H2O），1.81g/L.硫酸锌（ZnSO4·7H2O），0.22g/L.硫酸铜（CuSO4·5H2O），0.08g/L.钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），0.02g/L.3. 制备方法：将硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠、柠檬酸铁铵等试剂分别溶解在适量的蒸馏水中，搅拌均匀。

小新月菱形藻固定化培养初步研究陈书秀;王虎【摘要】用褐藻酸钙对小新月菱形藻进行固定化培养实验,测定不同胶粒大小、胶珠密度、CaCl2浓度及不同接种量对该藻的影响,比较了自由化生长与固定化细胞的生长曲线。

小新月菱形藻在褐藻酸钙凝胶中仍具有呼吸和光合作用的能力。

球径为3.5mm,CaCl2浓度为2%时,细胞生长快,每50mL培养液中加入200个胶珠时细胞生长量大,接种量不能低于104个细胞/mL。

与游离的小新月菱形藻相比,固定化小新月菱形藻生长慢,但生长周期长。

%Nitzschia closterium f.minutissima was immobilized in alginate beads. The effects of different immobilized conditons on the growth of the algae were tested.Among the immobilized conditions including the bead size, density, the concentration of CaCl2 and initial incoculation,the optimal immlbilized conditions for facilitating the growth of Nitzschia closterium f.minutissima were detemined. The growth curves of free living cells and immobilized cells were compared. The results showed that immobilized cells still had the ability of photosynthesis and respiration. The cells growth was largest when the cell density of microalga was more than 1×104cells/mL, the concentration of CaCl2 2%, the heads’diameter was 3.5 mm and 200 beads were added to 50 mL liquid culture medium. Compared with the free Nitzschia closteriumf.minutissima, the immlbilized Nitzschia closterium f.minutissima had slower growth rate, but longer growth period.【期刊名称】《生命科学仪器》【年(卷),期】2011(009)004【总页数】3页(P36-38)【关键词】小新月菱形藻;固定化;生长【作者】陈书秀;王虎【作者单位】山东东方海洋集团有限公司,山东烟台264003;烟台海融生物技术有限公司,山东烟台265600【正文语种】中文【中图分类】Q943.1小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)俗称“小硅藻”，是我国较早培养和应用的单胞藻饵料，其个体小，繁殖快，脂肪含量高，环境适应能力强，可作为理想的保健食品，在海水养殖业中占有重要地位。