第一章基因工程

高中生物选修3第一章基因工程习题1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于治疗其他非典病人。

有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图所示。

请根据下图回答：SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X[乙的研究] 注射 注射灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D减毒处理动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D（1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。

（2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。

（3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。

图中使健康人C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。

（4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种或多种 提供科学依据。

2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。

反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。

（1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。

（2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是。

（3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处：① 。

② 。

③ 。

3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色体中。

用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。

基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。

——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。

——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。

——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。

②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。

哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

基因工程的基本操作程序教案第一章：基因工程概述1.1 基因工程的定义解释基因工程的含义和概念强调基因工程在生物技术和农业生产中的重要性1.2 基因工程的历史发展回顾基因工程的发展历程和里程碑事件介绍基因工程的发展趋势和未来展望第二章：基因克隆与DNA重组技术2.1 基因克隆的基本概念解释基因克隆的含义和目的强调基因克隆在基因工程中的重要性2.2 DNA重组技术的原理与应用介绍DNA重组技术的原理和方法强调DNA重组技术在基因克隆和基因工程中的应用第三章：基因转移与表达3.1 基因转移的方法与策略介绍常见的基因转移方法，如转化、转染和感染强调不同基因转移方法的适用范围和优缺点3.2 基因表达的调控与分析介绍基因表达调控的机制和因素强调基因表达分析的方法和技巧第四章：基因编辑技术4.1 基因编辑技术的基本原理介绍基因编辑技术的含义和原理强调基因编辑技术在基因工程中的应用和优势4.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用详细介绍CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理和方法强调CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因工程中的应用案例第五章：基因工程的应用领域5.1 农业领域的应用介绍基因工程在农业生产中的应用，如转基因作物和抗病抗虫植物强调基因工程在提高作物产量和抗逆性方面的潜力5.2 医学领域的应用介绍基因工程在医学领域的应用，如基因治疗和药物研发强调基因工程在疾病治疗和药物研发方面的前景第六章：分子标记技术6.1 分子标记概述解释分子标记的含义和作用强调分子标记在基因工程中的重要性6.2 分子标记技术的方法与应用介绍常见的分子标记技术，如PCR、电泳和探针杂交强调不同分子标记技术的适用范围和优缺点第七章：基因表达谱分析7.1 基因表达谱分析的基本概念解释基因表达谱分析的含义和目的强调基因表达谱分析在基因工程中的重要性7.2 基因表达谱分析的方法与技术介绍常见的基因表达谱分析方法，如Northern blot、微阵列和测序强调不同基因表达谱分析方法的适用范围和优缺点第八章：基因敲除与基因沉默8.1 基因敲除技术的基本原理解释基因敲除的含义和原理强调基因敲除技术在基因工程中的应用和优势8.2 基因沉默技术的方法与应用介绍常见的基因沉默技术，如RNA干扰和CRISPR/Cas9强调不同基因沉默技术的适用范围和优缺点第九章：基因工程生物的安全性与伦理问题9.1 基因工程生物的安全性讨论基因工程生物对生态系统和人类健康的影响强调转基因生物的安全评估和监管措施9.2 基因工程伦理问题讨论基因工程在伦理方面的争议和挑战强调基因工程伦理原则和社会责任第十章：基因工程实验操作实例10.1 基因克隆与表达的实验操作详细讲解基因克隆与表达的实验步骤和方法提供实验操作实例和技巧10.2 基因编辑的实验操作详细讲解基因编辑的实验步骤和方法提供实验操作实例和技巧重点和难点解析六、分子标记技术分子标记的选择与设计：如何选择合适的分子标记，以及如何设计分子标记，是实验成功的关键。

第一章基因工程第1课时基因工程的诞生、发展和工具目标导航 1.说出基因工程诞生的理论与实践依据、发展阶段和基因工程的含义及其主要实验成果。

2.举例说出限制性核酸内切酶的作用、特点。

3.举例说出DNA连接酶的作用。

4.简述质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。

一、基因工程的诞生和发展1．基因工程是指在______通过人工“______”和“____________”等方法，对生物的基因进行的______和重新组合，然后______受体细胞并使重组基因在受体细胞中______，产生人类需要的____________的技术，又称为________技术。

基因工程是在______水平上操作、改变生物的______________的技术，包括基因的______、____________、______以及在受体细胞内的______和______等过程。

2．艾弗里证明了______是遗传物质、沃森和克里克阐明了______________________结构，尼伦贝格等破译了____________，这些都为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而________________酶和________酶等工具酶、________等载体和________酶的发现，则直接促使了基因工程的诞生。

3．基因工程的诞生和发展经历了三个时期：1973～1976年为______期；1977～1981年为______期；1982年以后为迅猛发展和____________期。

1973年，美国科学家科恩和博耶等将________________的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的______，创立了________________的新技术——基因工程；不久，又有科学家将第一个____核生物的基因导入大肠杆菌，使大肠杆菌产生了相应的______；1977年，科学家使得生长激素抑制素基因在大肠杆菌中成功表达；1978年，____________在大肠杆菌中成功合成；1979年，____________基因在大肠杆菌中成功表达；1980年，____________基因在大肠杆菌中成功表达……1982年，美国科学家岶米特等采用____________法，将经过重组的带有________________基因的质粒转入小鼠的受精卵内，成功获得带有________________基因的小鼠。

基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。

2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。

如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。

并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。

4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。

②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。

③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。

5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。

（完整版）⾼中⽣物选修3教案第⼀章基因⼯程⼀.基本⼯具(⼀)限制性核酸内切酶1.分布:原核⽣物2.作⽤:⼀种限制酶只能识别⼀种特定的核苷酸序列,并且在特定部位进⾏切割,使两个核苷酸间的磷酸⼆酯键断开。

3.作⽤结果：产⽣黏性末端或平末端（⼆）DNA连接酶1.分类（1）E.coliDNA连接酶来源：⼤肠杆菌功能：只能连接黏性末端（2）T4DNA连接酶来源：T4噬菌体功能：连接黏性末端和平末端2.作⽤：将DNA连接起来（三）基因进⼊受体细胞的载体1.条件（1）具有多个限制酶切割位点，供外源基因插⼊（2）可⾃我复制或整合到染⾊体DNA中进⾏同步复制。

（3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择2.种类：λ噬菌体的衍⽣物、动植物病毒、质粒质粒：双链环状DNA分⼦，最常⽤，要⼈⼯改造⼆。

基本操作程序（⼀）⽬的基因的获取1.⽬的基因：编码蛋⽩质的基因或具有调控作⽤的因⼦2.获取⽅法（1）从基因⽂库中获取**基因组⽂库，部分基因⽂库（2）利⽤PCR技术扩增⽬的基因（3）化学⽅法直接⼈⼯合成：基因⼩，核苷酸序列已知（⼆）基因表达载体的构建（核⼼步骤）1.⽬的(1)稳定存在，遗传给下⼀代（2）表达和发挥作⽤2.结构：启动⼦、⽬的基因、终⽌⼦、标记基因、复制原点**启动⼦：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录**终⽌⼦：使转录在所需要的地⽅停⽌；**标记基因：鉴别受体细胞中是否含⽬的基因。

（三）将⽬的基因导⼊受体细胞1.转化：⽬的基因进⼊受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达2.将⽬的基因导⼊植物细胞（1）农杆菌转化法（2）基因枪法（3）花粉管通道法3.将⽬的基因导⼊动物细胞：显微注射法4.将⽬的基因导⼊微⽣物细胞：Ca+处理使细胞处于感受态**原核细胞特点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少（四）⽬的基因的检测与鉴定1.分⼦⽔平的检测（1）检测受体细胞中是否插⼊了⽬的基因:DNA分⼦杂交技术（2）检测⽬的基因是否转录出了 mRNA：DNA分⼦杂交技术（3）检测⽬的基因是否翻译成蛋⽩质：抗原—抗体杂交法**检测成功会出现杂交带2.个体⽣物学⽔平的鉴定：接种实验三．基因⼯程的应⽤1.动物、植物基因⼯程的成果（1）植物：提⾼抗逆性、改良品质、⽣产药物；（2）动物：品种改良、建⽴⽣物反应器、器官移植；2.基因⼯程药物：细胞因⼦、抗体、疫苗、激素；3.基因治疗（1）概念：（2）⽅法体外基因治疗体内基因治疗四．蛋⽩质⼯程的崛起1.理论推测，⼈⼯合成2.基因⼯程，蛋⽩合成（⾃然界没有的蛋⽩质）第⼆章细胞⼯程⼀.细胞⼯程1.原理和⽅法:细胞⽣物学和分⼦⽣物学2.操作⽔平:细胞⽔平或细胞器⽔平3.⽬的:按照⼈们的意愿改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品4.分类:植物细胞⼯程和动物细胞⼯程⼆.植物细胞⼯程的基本技术(⼀)植物组织培养技术1.原理:植物细胞具有全能性2.条件(1)材料:离体(2)培养基:营养激素(3)外界条件:⽆菌等3.过程:离体组织器官脱分化愈伤组织再分化胚状体植株(⼆)植物体细胞杂交技术1.概念:不同种杂种细胞植物体2.原理：植物细胞具有全能性3.过程(1)制备原⽣质体⽅法①酶解法②酶:纤维素酶和果胶酶③结果:获得原⽣质体(2)诱导原⽣质体融合①⽅法:a物理法离⼼、振动、电激b化学法:聚⼄⼆醇(PEG)②标志:杂种细胞再⽣出细胞壁③结果：形成杂种细胞（3）杂种细胞的筛选：AA BB AB AB（4）植物组织培养：杂种细胞杂种植株4.意义：克服远缘杂交不亲和的障碍**⽣殖⽅式：⽆性⽣殖变异类型：染⾊体数⽬变异（三）实际应⽤1.植物繁殖的新途径（1）微型繁殖：植物组织培养（2）作物脱毒：茎尖组织培养（3）⼈⼯种⼦：胚状体、芽+ ⼈⼯薄膜**可加⼊固氮菌、抗⽣素、除草剂等有利于⽣长和提⾼产量2.作物新品种的培育（1）单倍体育种（2）突变体的利⽤3.细胞产物的⼯产化⽣产（1）细胞产物种类蛋⽩质、糖类、药物、⾹料、⽣物碱（2）⼀般为愈伤组织时期第⼆课时三．动物细胞⼯程（⼀）动物细胞培养的过程细胞株取材处理单个细胞培养细胞悬浮10代细胞原代培养1.取材：胚胎细胞或幼龄动物的组织器官2.处理：剪碎、胰蛋⽩酶或胶原蛋⽩酶3.培养：（1）培养基：液体培养基、合成培养基（2）条件①⽆菌⽆毒环境（灭菌抗⽣素更换）②营养:、、维⽣素、动物的⾎清、⾎浆③温度PH:36.5+/-0.5 7.2~7.4④⽓体环境：O2代谢所必需；CO2维持培养液PH4.原代培养：细胞贴壁、接触抑制、冷冻保存（1~10代）5.传代培养：①酶处理、分装；②细胞株：10~50代，正常③细胞系：50代以后，有癌变特点6.应⽤：⽪肤移植、⽣产蛋⽩质制品、有毒物质的检测、研究四.动物细胞核移植和克隆动物1.概念:核移植重组胚胎个体2.原理:动物细胞核具有全能性3.分类:胚胎细胞核移植和体细胞核移植4.过程:见课本5.应⽤与存在的问题(1)畜牧业、保护濒危物种、医药卫⽣、治疗疾病、器官移植(2)问题:成功率低健康问题⾷品安全问题五.动物细胞融合1.概念:2.原理:细胞膜的流动性3.⽅法(1)物理法(2)化学法(3)⽣物法：灭活的病毒4.意义：5.⽤途：制备单克隆抗体六.单克隆抗体1.概念:化学性质单⼀,特异性强的抗体2.制备过程(1)免疫动物：注⼊特定抗原(2)细胞融合：灭活病毒(3)筛选杂交瘤细胞①⽤选择培养基筛选出杂交瘤细胞②抗体—抗原杂交检测出能产⽣特定抗体的杂交瘤细胞(4)⽣产并提纯单克隆抗体①体内：动物腹腔②体外：液体培养基3.优点:特异性强灵敏度⾼能⼤量制备应⽤:(1)诊断(2)治疗:⽣物导弹第三章胚胎⼯程⼀．精⼦的发⽣1.场所：睾丸2.时间：初情期⽣殖机能衰退有丝分裂精原细胞3.过程：精原细胞MI MII 精细胞变形精⼦4.变形：细胞核头部⾼尔基体頂体中⼼体尾部线粒体线粒体鞘其他物质原⽣质滴（脱落）**精⼦的⼤⼩与动物体型的⼤⼩⽆关⼆．卵⼦的发⽣1.场所：卵巢输卵管2.时间：胎⼉期初情期3.过程：（1）胎⼉期卵原细胞有丝分裂卵原细胞复制卵泡形成：初级卵母细胞+ 卵泡细胞（卵巢）卵巢MI（2）初情期排卵次级卵母细胞+ 第⼀极体（输卵管）受精输卵管MII合⼦+ 第⼆极体**卵⼦发⽣过程中MI MII不连续**初级卵母细胞周围形成透明带**卵⼦受精的标志:卵细胞膜与透明带间可观察到两个极体**精卵发⽣的重要区别：胎⼉期卵泡的形成和储备三．受精1.场所：输卵管2.过程：（1）精⼦获能：场所为雌性⽣殖道内（2）卵⼦准备：发育⾄MII中期（3）受精阶段：①精⼦穿越放射冠和透明带a頂体反应：释放頂体酶b透明带反应：防⽌多精⼊卵受精（第⼀道屏障）②进⼊卵细胞膜a时间：精⼦⼊卵后b作⽤：防⽌多精⼊卵受精（第⼆道屏障）③原核形成和融合a精⼦头尾分离形成雄原核b受精后MII，排极体，形成雌原核c雄原核与雌原核融合四．胚胎发育（⼀）卵裂 1.受精卵：个体发育的起点2.桑椹胚：之前细胞具有全能性3.囊胚：开始分化内细胞团（个⼤) 滋养层(个⼩)具有囊胚腔***卵裂特点:有丝分裂细胞增多总体积不变或缩⼩***孵化:透明带破裂(⼆)原肠胚(1)内细胞团:外胚层内胚层原肠腔组织器官(2)滋养层:胎盘和胎膜第⼆课时胚胎⼯程⼀．体外受精五．卵母细胞的采集和培养1.⼩型动物（1）处理：促性腺激素超数排卵（2）场所：输卵管中冲取卵⼦2.⼤型动物（1）场所：卵巢（2）培养：⼈⼯培养⾄MII中期（⼆）精⼦的采集和获能1.收集精⼦的⽅法（1）假阴道法（2）⼿握法（3）电刺激法2.精⼦获能的⽅法（1）培养法：获能液（2）化学诱导法：肝素或钙离⼦载体A23187溶液+ 化学药物（三）受精：获能溶液或专⽤的受精溶液⼆．胚胎的早期培养1.发育培养液（1）成分：有⽆两素两酸⾎清（2）继续发育检查发育能⼒2.结果：早期胚胎三．胚胎移植的⽣理基础1.发情处理后，供体、受体⽣殖器官的⽣理变化相同2.早期胚胎处于游离状态，可收集3.受体对外来胚胎基本上不发⽣免疫排斥反应4.孕育过程中胚胎的遗传特性不受影响四．胚胎移植的基本程序1.对供体、受体的选择和处理（1）选择①供体：遗传性能和⽣产性能优秀②受体：体质和繁殖能⼒正常（2）处理①性激素：同期发情处理②促性腺激素：超数排卵2. 配种或⼈⼯受精3.对胚胎的收集、检查、培养或保存①收集：⼦宫中冲卵②检查：桑椹胚或囊胚③保存：-196℃液氮4.胚胎移植（1）⼿术法（2）⾮⼿术法5.妊娠检查、分娩****优势：充分发挥雌性优良个体的繁殖能⼒五．胚胎分割1.概念：机械2n移植2.⽣殖⽅式：⽆性⽣殖3.仪器设备：实体显微镜和显微操作仪4.分割时期：发育良好形态正常的桑椹胚或囊胚**囊胚分割时注意将内细胞团均等分割**性别鉴定和胚胎分割取材部位不同5.意义：提⾼胚胎利⽤率六．胚胎⼲细胞1.来源：早期胚胎细胞和原始性腺2.特性（1）形态：细胞体积⼩、核⼤、核仁明显（2）功能：细胞具有全能性****体外培养只增殖⽽不分化3.应⽤：体外诱导分化治疗疾病⽤于研究。

第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。

高二生物选修3第一章基因工程习题一．单选题：每小题只有一个选项最符合题意。

1．下列有关基因工程的叙述，正确的是：（C ）A．DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外D．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等2．下列关于基因工程的叙述，正确的是：（B ）A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B．细菌质粒是基因工程常用的运载体C．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA D．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体3．与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是：（C ）A．反转录酶B．RNA聚合酶C．DNA连接酶D．解旋酶4．限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是：（D ）A．G与A之间的键B．G与C之间的键C．A与T之间的键D．磷酸与脱氧核糖之间的键5．下面图中a、b、c、d代表的结构正确的是：（D ）A．a—质粒RNA B．b—限制性外切酶C．c—RNA聚合酶D．d—外源基因6．除下列哪一项外，转基因工程的运载体必须具备的条件是：（D ）A．能在宿主细胞中复制并保存B．具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接C．具有标记基因，便于进行筛选D．是环状形态的DNA分子7．目的基因与运载体结合所需的条件是：（D ）①同一种限制酶②具有标记基因的质粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA连接酶⑥四种脱氧核苷酸⑦A TPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦8．下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是：（C ）A．染色体只存在于真核生物细胞中，质粒只存在于原核生物细胞中B．在基因工程中染色体和质粒均可以作为运载体C．染色体和质粒均与生物的遗传有关D．染色体和质粒的化学本质相同9．苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞是否已表达，其检测方法是：（C ）A．是否有抗生素抗性B．是否能检测到标记基因C．是否有相应的性状D．是否能分离到目的基因10．如果科学家通过转基因工程，成功地把一名女性血友病患者的造血细胞进行改造，使其凝血功能恢复正常。

《基因工程》习题集第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？3.简述基因工程的发展简史。

4.基因工程有哪些主要应用？5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。

第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？5. 什么是穿梭载体？6. 表达载体应该具备什么条件？7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？8. DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？10. 碱性磷酸酶有什么作用？11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。

15. 请描述用载体pUC18来克隆DNA片段的过程。

在这个克隆实验中，你怎样选择含有克隆片段的重组子？第三章基因工程的常规技术1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC荧光（显色酶）标记法？5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？9. 简述PCR技术的基本原理。

10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？11. 提高PCR反应特异性的因素有哪些？12. 什么是逆转录PCR？13. 什么是反向PCR?14. 什么是多重PCR？15. 什么是荧光定量PCR？16. 什么是基因芯片技术？17. DNA芯片有哪些主要的应用？18. 什么是蛋白质芯片？19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？21. 构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？22. 合成cDNA第二条链有哪些方法？23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。

第一章基因工程第一节基因工程概述由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。

二．基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

（二）“分子针线”——DNA连接酶1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。

(三)“分子运输车”——载体1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。

最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。

三．基因工程的基本过程(一) 获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。

②用人工的方法合成。

★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。

★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。

第一节基因工程概述一、选择题1.质粒之所以能作为基因工程的载体,其理由是( )A.含蛋白质,从而能完成生命活动B.具有环状结构而保持连续性C.RNA能指导蛋白质的合成D.能够自我复制,能携带目的基因解析:质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外,并能自我复制的双链环状DNA分子。

其上有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点,供一种或多种外源DNA片段插入。

携带外源DNA片段的质粒在受体细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上,随染色体DNA进行同步复制。

此外,质粒DNA上有特殊的遗传标记基因。

答案:D2.基因工程是DNA分子水平的操作,下列有关基因工程的叙述,错误的是( )A.限制性核酸内切酶只用于切割获取目的基因B.载体与目的基因必须具有相同的黏性末端,才能被DNA连接酶连接C.基因工程所用的工具酶是限制性核酸内切酶,DNA连接酶D.带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测解析:在基因工程中,需要用限制性核酸内切酶切割目的基因和载体,以便产生能相互连接的黏性末端;在将具有互补黏性末端的DNA片段连接时需要DNA连接酶;带有目的基因的载体是否进入受体细胞要用标记基因检测。

答案:A3.下列有关限制性核酸内切酶识别的叙述,不正确的是( )A.从反应类型来看,限制性核酸内切酶催化的是一种水解反应B.限制性核酸内切酶的活性会受温度、pH等外界条件的影响C.一种限制性核酸内切酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列D.限制性核酸内切酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的几率就越小解析:限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。

其作用对象是磷酸二酯键,能使其断裂。

酶的活性受温度、pH的影响。

一种酶只能识别一种特定的核苷酸序列,序列越短,出现该序列的几率就越大。

答案:D4.人们常选用带有一个抗生素抗性基因的细菌质粒作为载体,该抗性基因的主要作用是( )A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.加强质粒分子的感染性D.便于与外源基因连接解析:标记基因的作用是利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。