GMP文件
纯化水需氧菌检查标准操作规程
目的：建立需氧菌检查法的标准操作规程，保证正确操作。
范围：本标准适用于纯化水的需氧菌检查。
依据：《中国药典》2015年版二部。
职责：QC检验员对本标准的实施负责。
正文：
1.简述
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
2.环境要求
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
3.仪器生物安全柜、洁净工作台、微生物限度检查仪、恒温培养箱、电热恒温水浴锅。
4.设备：滤杯、高压灭菌锅、剪刀、镊子、75％酒精棉球。
5.供试品：取纯化水10 mL。备用。
6.实验前准备
6.1. 培养基、冲洗液制备方法
6.1.1. R2A琼脂培养基：取本品18.2g，加1L纯化水，加热溶解，分装，121 ℃湿热灭菌20 min。
6.1.2. pH
7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液：pH 7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液干粉16.09 g，加水1000 ml，微温溶解，滤清，121 ℃湿热灭菌20 min。
6.2.用具的洗刷
6.2.1.玻璃器皿：如试管、三角瓶等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用纯化水洗涤4～5次，倒置，晾干。试管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。
6.2.2.剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用纯化水洗涤3次。
6.2.3.洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。
6.3. 用具的包扎及灭菌
6.3.1.洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。
6.3.2.试管口塞上胶塞、三角瓶等用8层纱布将瓶口扎紧。
6.3.3.一次性使用枪头用报纸包起来。
6.3.4.将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。
6.3.5.将0.45 μm滤膜放到滤杯中，过滤部分与杯体连接好后，用纱布包扎好。
6.3.6.将以上包扎好的用具在121 ℃蒸汽灭菌20 分钟。物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中干燥。
6.4.洁净室的清洁与灭菌
6.4.1.洁净室及生物安全柜，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。
6.4.2.在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2 %新洁尔灭溶液或2 %来苏尔或75 ％乙醇擦洗生物安全柜工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，生物安全柜空气过滤器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。
7. 实验步骤
开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。操作人员按《进入洁净室更衣程序》洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放入生物安全柜内。
7.1.供试液的制备
取纯化水10ml，加入到90mlpH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液中，振摇，制成1：10 的供试液。
7.2.样品检测（薄膜过滤法）
取7.1 项下制备的供试液10 ml，加入90 mLpH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45 μm混合纤维素膜）后，以pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液冲洗滤膜3次（100 ml/次），平行制备2 张滤膜。转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上。32 ℃倒置培养5 天，点计菌落数。
7.3.阴性对照组
取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液100 ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液冲洗滤膜3 次（100ml/
次），平行制备2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，32 ℃倒置培养5 天。
8.接受标准
1mL样品中需氧菌总数不得超过100 cfu。判为符合规定，否则，判为不符合规定。
