《酶的分离纯化》PPT课件
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酶学第五章 酶的分离纯化与制剂
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加 入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后 低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点： ① 能有效地破坏细胞壁（膜）；② 有利于除去大量脂类物质，以免 它在以后的步骤产生干扰；③ 能使某些膜结合酶易于溶解；④ 丙酮 干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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第二节 酶的抽提
抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。
主要内容：预处理和破细胞
抽提
浓缩
一、预处理和破细胞
着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将 完整材料立即冰冻保存。
最终目的（ 获得高度纯净的酶制剂 ）
整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；
(2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从 包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；
(3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。
酶的分离纯化
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College of Life Sciences
五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
27
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酶的分离纯化第五节 结晶法
B 第一介稳区：加
入晶种结晶会生长， 但不产新晶核 C 第二介稳区：加 入晶种结晶会生长， 同时有新晶核产生 A 稳定区：不饱和 区 D 不稳区：瞬时出 现大量微小晶核， 发生晶核泛滥
二 结晶过程
(1) 过饱和溶液的形成 (2) 晶核生成
(3) 晶体的生长
注：溶质浓度差为推动力
1、过饱和溶液的形成方法
从总体上来说，过饱和溶液是处于不平衡 的状态，是不稳定的，若受到振动或者加入 溶质的晶体，则溶液里过量的溶质就会析出 而成为饱和溶液，即转化为稳定状态，这说 明过饱和溶液没有饱和溶液稳定，但还有一 定的稳定性。因此，这种状态又叫介稳状态。 过饱和度S（%）：S=C/C’ ×100%
c ,c’ 分别为过饱和及饱和溶液的浓度
过饱和溶液能存在的原因：是由于溶质不
容易在溶液中形成结晶中心（即晶核）。 因为每一晶体都有一定的排列规则，要有 结晶中心，才能使原来作无秩序运动着的 溶质质点集合起来，并且按照这种晶体所 特有的次序排列起来。不同的物质，实现 这种规则排列的难易程度不同，有些晶体 要经过相当长的时间才能自行产生结晶中 心，因此，有些物质的过饱和溶液看起来 还是比较稳定的。
四 工业结晶成核的控制
1、维持稳定的过饱和度 2、限制晶体的生长速度，不以盲目提高过饱和 度的方法来达到提高产量的目的 3、尽可能减低晶体的机械碰撞能量及几率，长 浆叶、慢搅拌是常用的方法 4、对溶液进行加热、过滤等预处理 5、及时排出符合要求的晶粒 6、调节原料溶液的pH值或加入某些具有选择性 的添加剂，改变成核速率
三 结晶操作
1 分批结晶
步骤： (1) 结晶器的清洁 (2) 加料到结晶器中 (3) 产生过饱和度 (4) 成核与晶体生长（一般采用加晶种缓慢冷却方 法操作，溶液可始终保持在介稳态，而晶体的生长 速率完全由冷却速度加以控制，可使溶液不致进入 不稳区，所以不会发生初级成核现象，这种“控制 结晶”的操作方法能够产生预定粒度的、合乎质量 要求的匀整晶体） (5) 晶体的排除
蛋白类酶的分离纯化
等密度梯度离心: 分离密度不一样颗粒，欲分离颗粒 处于密度梯度中等密度点（平衡）才可停顿离心， 操作时先把一定浓度介质溶液与样品液混合均匀。 （密度不一样，分子量相近）梯度陡峭，密度较 高
蛋白类酶的分离纯化
第23页
密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度 梯度系统, 贮液室与混合室截面积关系决定梯度类 型。
离心分离是借助于离心机旋转所产生离心力, 使不一 样大小、不一样密度物质分离技术过程。
在离心分离时, 要依据欲分离物质以及杂质颗粒大小、 密度和特征不一样, 选择适当离心机、离心方法和离心条 件。
常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内, 相对离心力（RCF）在1×104 g 以下, 在酶 分离纯化过程中, 主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣 等固形物分离。也用于酶结晶等较大颗粒分离。
利用两性电解质在等电点时溶解度最 低，以及不一样两性电解质有不一样 等电点这一特征，经过调整溶液pH值 ，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与
第15页
在盐浓度到达某 一界限后, 酶溶 解度随盐浓度升 高而降低, 这称 为盐析现象。盐 析主要原理在于 高浓度盐离子与 蛋白质争夺水化 水, 破坏蛋白质 分子表面水化膜, 同时因为反离子 作用, 也影响蛋 白质分子所带电 荷
在盐析时, 溶液中硫酸铵浓度通常以饱和度 表示（指溶液中加入饱和硫酸铵体积与混合溶液 总体积比值）
解读蛋白质工程p204页表7－3
蛋白类酶的分离纯化
第18页
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是因
为有机溶剂存在会使溶液介电常数降低。 比如, 20℃时水介电常数为80, 而82％乙醇水 溶液介电常数为40。
酶都能溶解于水, 通常可用水或稀酸、稀碱、稀 盐溶液等进行提取, 有些酶与脂质结合或含有较 多非极性基团, 则可用有机溶剂提取。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程总结PPT课件
酶固定化技术包括固定化载体、固定化方法、固定化酶的分离和回收等关键技术 ，这些技术的应用能够为酶工程提供高效、连续化的生产方式。
酶的分子改造技术
酶的分子改造技术是通过化学或生物 方法对酶的分子结构进行修饰和改造， 从而改变酶的催化性质和功能的技术。
酶的分子改造技术包括化学修饰、定 向进化、点突变等关键技术，这些技 术的应用能够优化酶的催化性能和稳 定性，提高酶的生产效率和降低成本。
THANKS
生物能源开发
酶工程技术可用于生物能源开发，如生物柴油、生物 酒精等。
06
酶工程的前景与挑战
酶工程的发展前景
酶工程在工业生产中的应用前景广阔，特别是在生物制药、生物燃料、环保等领域。
随着酶工程技术的不断进步，酶的产量、活性和稳定性将得到进一步提高，为工业 生产提供更高效、环保的解决方案。
酶工程在医疗领域的应用前景也十分看好，例如用于药物设计和开发、疾病诊断和 治疗等。
环保领域的应用
有毒有害物质降解
01
酶工程技术可用于降解有毒有害物质，如重金属、有机污染物
等。
废水处理
02
酶工程技术可以用于废水处理，通过酶促反应将废水中的有机
物转化为无害物质。
生物修复
03
酶工程技术可用于生物修复，通过酶促反应降解污染物，恢复
生态环境。
食品工业领域的应用
食品添加剂生产
酶工程技术在食品添加剂生产中发挥着重要作用，如生产甜味剂、 防腐剂等。
专一性
一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，具有明显的专一性。
不稳定性
大多数酶是蛋白质，容易受温度、pH、重金属离子等环境因素的影响，表现出不稳定性。
酶的活性调节
1 2
共价修饰
酶的分子改造技术
酶的分子改造技术是通过化学或生物 方法对酶的分子结构进行修饰和改造， 从而改变酶的催化性质和功能的技术。
酶的分子改造技术包括化学修饰、定 向进化、点突变等关键技术，这些技 术的应用能够优化酶的催化性能和稳 定性，提高酶的生产效率和降低成本。
THANKS
生物能源开发
酶工程技术可用于生物能源开发，如生物柴油、生物 酒精等。
06
酶工程的前景与挑战
酶工程的发展前景
酶工程在工业生产中的应用前景广阔，特别是在生物制药、生物燃料、环保等领域。
随着酶工程技术的不断进步，酶的产量、活性和稳定性将得到进一步提高，为工业 生产提供更高效、环保的解决方案。
酶工程在医疗领域的应用前景也十分看好，例如用于药物设计和开发、疾病诊断和 治疗等。
环保领域的应用
有毒有害物质降解
01
酶工程技术可用于降解有毒有害物质，如重金属、有机污染物
等。
废水处理
02
酶工程技术可以用于废水处理，通过酶促反应将废水中的有机
物转化为无害物质。
生物修复
03
酶工程技术可用于生物修复，通过酶促反应降解污染物，恢复
生态环境。
食品工业领域的应用
食品添加剂生产
酶工程技术在食品添加剂生产中发挥着重要作用，如生产甜味剂、 防腐剂等。
专一性
一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，具有明显的专一性。
不稳定性
大多数酶是蛋白质，容易受温度、pH、重金属离子等环境因素的影响，表现出不稳定性。
酶的活性调节
1 2
共价修饰
实验8-酶的分离纯化
很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可 逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实 验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要， 可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆， 并使产物抑制成为最小。
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
C
OH
COOH
H3C
COOH H3C
OH
A BC
A BC
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
目录
主要内容
➢ 单底物酶处反应动力学 ➢ 酶的分离纯化
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
k1
ES
[ES]生成速度：v 1 k 1 E t ES S ，[ES]分解速度：v 2 k 1 E S k 2 ES
米
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
氏 方 程 的 推 导
即： k 1 E t E S S k 1 E k 2 S E S EtSE E SSSk1k 1k2
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
C
OH
COOH
H3C
COOH H3C
OH
A BC
A BC
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
目录
主要内容
➢ 单底物酶处反应动力学 ➢ 酶的分离纯化
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
k1
ES
[ES]生成速度：v 1 k 1 E t ES S ，[ES]分解速度：v 2 k 1 E S k 2 ES
米
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
氏 方 程 的 推 导
即： k 1 E t E S S k 1 E k 2 S E S EtSE E SSSk1k 1k2
1-亲和分离纯化胰酶课件
6-2、测定酶活力试剂与配制
6-2-1、试剂
（1）、Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐 (BAPNA)
（2）、三乙醇胺
（3）、氯 化 钙
（4）、硫 （5）、盐 酸 酸
6-2-2、 试剂的配制
(1）、底物（B）的配制 [ mg/ml ] ： （2）、缓冲溶液（S）[TEA-2]： （3）、0.5 mol/L H2SO4溶液的配制： （4）、样品溶液的配制： 直接按照测定步骤，分别吸取自动部分收集器收集的各管样 品原液。
（1）、表1：酶活力的测定方法与结果表
试剂 / 管 号 缓 冲 液（ml）
0
1
2
3
4
5
6
2.0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
样 品 溶 液 (ml)
1.4 1.2 1
A 405 nm
0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8 管 号
胰蛋白酶分离效果图 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8
管 号
吸光度[280nm]
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 -0.2
蛋白质洗脱峰
胰蛋白酶活力峰
亲和层析
分离纯化胰蛋白酶
一
实验原理
我们都知道酶和它的底物或竞争性抑制剂，特异性抗原和抗体， 激素及其受体等具有专一性很强的亲和能力。亲和层析是利用生物分 子间所特有的专一亲和力而设计的一种层析技术。 亲和层析就是在一种载体上，用化学偶联的方法，接上特定的配 基作为固相支持物，然后装柱，并在适当的条件下当样品通过柱子时， 其中与配基具有特异性亲和力的组分被吸附在柱上，然后通过改变洗 脱条件，使得该组分被洗脱分离开来。 亲和层析是具有快速、高效等特点，对于那些分离流程长、难度 大、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说， 亲和层析显示出其独特的优越性。 通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可高达数百倍，活 性回收率纯度也非常之高。亲和层析先决条件是，不同的分离对象需 要选择接有专一性配基的固相化亲和载体，有关载体的活化、接臂、 偶联，详见相关一书。
3.蛋白质与酶工程 酶的提取、分离和纯化
（5）冷冻干燥（浓缩）
3-2 常用的分离纯化方法
1、沉淀分离
例 盐析纯化血清免疫球蛋白
取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀 搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为20％ ↓4℃，10min 离心(3000rpm), 10min，弃沉淀 上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50％ 。 ↓置4℃，3小时以上 离心(3000rpm), 10min，弃上清 所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml ↓ 装入透析袋中对PBS充分透析（换液3次） ↓萘氏试剂测透析外液无黄色 取少许透析袋液适当倍数稀释后，测蛋白含量。
解吸方法--洗脱原理
蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子 交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交 换剂之间的离子键）的常用方法：
①加大反离子的浓度，常用的反离子是NaCl ②改变溶液的pH （改变结合基团的电荷） ③同时改变pH与离子强度
分离酶蛋白时交换剂选择的一般原则：
根据酶稳定性的需要：
1、定义 在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料， 使酶充分溶于其中的过程。
2、提取液的选择
根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液 *极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶 *酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。
2-4 酶的提取
3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水 作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐 溶液进行抽提 4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则 可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂 肪或磷脂膜分离；
等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度离心
A.差速-区带(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度 液中沉降速度的不同，在离心力作用下处于不同 密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分 离的目的。 方法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质 （如蔗糖、甘油、CsCl等），待分离的样品以很 薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于 不同组份在梯度液中沉降速率的差别，而在离心 的某一时刻形成了数个分别含不同组份颗粒的区 带。
酶的分离
大多数蛋白类酶都溶 于水，而且在低浓度 的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度 的升高而增加，这称 为盐溶现象。
在盐浓度达到某一 界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而 降低，这称为盐析 现象。
举例说明
盐溶液提取
例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞 外酶，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液提取等。有少数酶，如 霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。 核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取 液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶 RNA。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀 法 等电点沉 淀法 有机溶剂 沉淀法 复合沉淀 法
利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解 度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度 的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀， 从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以 及不同的两性电解质有不同的等电点这一特 性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀 析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不 同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶 或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合 物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
三 、离心条件
在离心过程中，应该根据需要，选择好离心 力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温 度和 pH 值等条件。
1.
离心力
相对离心力
2、离心时间 3、温度和 pH 值
（三 ） 过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形 状的物质分离的技术。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、 纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以 各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜 分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析及电 渗析等都属于膜过滤技术。
酶的分离与纯化
● 鹽溶 Salting-in:
加鹽使蛋白質溶入水溶液中
● 鹽析 Salting-out:
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
設計純化步驟時，需考慮下列各項要求
• • • •
a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
組合純化步驟
• a. 組合標準 • (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行， 有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠 体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法， 組成全部流程。 • (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純 化，看其結果如何再加改進。 • (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化， 如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑 制劑或熱穩定性等。
• 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影 響結果的好壞： • (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本 在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在 膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造 成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析 力降低甚多。 • (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体 時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗 等。
近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不 論人類或是分子皆同
色谱的类型
. 常用的層析方法
膠體過濾法
• 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩 衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分 佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球， 隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內 的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、 大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但 一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響 力。
酶的透析分离技术ppt课件
透析膜
小分子 大分子
水（缓冲液）
被截留
三、透析分离出的物质
透析在酶的分离纯化过程中极为 常用。通过透析可以除去酶液中 的盐类、有机溶剂、低分子量的 抑制剂等小分子物质。当透析膜 （袋）的截留极限一般在分子量 5000左右。
四、透析的操作
1、透析袋的处理 2、透析袋的检查 3、装样 4、透析
五、酶液透析的操作工艺流程
一、实验原理
透析是一种膜分离技术，是利用小分子物 质的扩散作用和半透膜两侧溶质浓度差为 传质推动力，从溶液中恨你出小分子物质 二截留大分子物质的过程。
透析时，样品液装在透析袋内，袋外史谁 活着缓冲液，在一定的温度下，透析一段 时间后，样品液中的小分子物质不断地从 透析袋内透出到袋外。
二、透析原理示意图
附：透析袋透析的简单装置示意图样液透析袋处理
装样
扎袋
透析 透析检查
2~5℃低温下； 使用缓冲液
4、透析：
取一个大烧杯，加入20倍以上样品体积的 0.01mol/L的pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，将 装好样品的透析袋悬于大烧杯中部，底部 放一个搅拌子（磁棒），用磁力搅拌器缓 慢搅拌以促进溶液交换。透析过程中需要 换洗脱溶数次，使小分子由高浓度向低浓 度的扩散作用继续进行，直至达到透析平 衡为止。
第三章 酶的分离纯化
Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
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精品医学
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀 酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中
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精品医学
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短 扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的 扩散速度，从而增大提取效果。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
精品医学
机械法（注意预冷）：
捣碎法： 10000rpm
研磨法： 匀浆法：研杆和管壁
间只有几百微米
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
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精品医学
物理法：
反复冻融法：时间长，需加蛋 白酶抑制剂（PMSF、EDTA 等）
超声波处理法：处理时间尽量 短，避免局部过热使得酶失活
渗透压法： 冷热交替法：
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JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高压细胞破碎机
精品医学
动物
细菌
植物
∣研磨 ∣超声波
∣纤维素酶
∣匀浆 ∣溶菌酶
∣
↓捣碎机 ↓化学溶剂 (甲苯) ↓
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精品医学
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
1（酶解破碎） 5
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在 提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取 条件。
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精品医学
⑴ 盐溶液提取：
一般以低盐溶液(0.05-0.2mol/L)为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大， 是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。
– 盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐 浓度增大而增大
谱法。
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精品医学
主要过程： 细胞破碎 酶的提取 离心分离 过滤 沉 淀 层析 电泳 萃 取浓缩干燥 结晶 保存。。。
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精品医学
一、酶分子制备的前处理
1、生物材料的选择
选择目的酶含量高的 选择容易取材的 利用细胞培养技术和基因工程重组DNA技术。 目前，酶的来源大都为来自微生物
– 盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解
度随着盐浓度增大而降低
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精品医学
大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓
度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐
浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。
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精品医学
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精品医学
(2)稀酸（碱）溶液提取
在偏离等电点0.5左右，溶解度增大 根据等电点，选择合适的pH 注意，不能采用极端pH值，操作时要注意避
第三章 酶的分离纯化与保存
酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。 针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化
的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。 酶的分离纯化又有其自身特点：
– 难点：目标酶在细胞中含量少 – 优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪 酶的分离纯化是一门实验科学
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精品医学
酶的分离纯化，就是将 酶从细胞或者其他含酶 的原料中释放出来，再 与杂质分开，而获得符 合研究和使用要求的酶 制品的过程
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精品医学
2、 细胞的破碎
将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分 释放到溶液中，并不丢失生物活性。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织， 其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同
– 如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微 生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细 胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
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精品医学
细胞结构与酶分布
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精品医学
胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到 各个作用部位，并不断补充和更新
胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质 空间、外膜及细胞外环境中的酶
不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破 碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后， 对余下的液体即可进行初步纯化
等等
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精品医学
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取
动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
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离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
精品医学
酶的分离纯化可以分为三个阶段
1、粗蛋白：多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以 外的物质；
2、部分纯化：使用各种层析法； 3、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色
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精品医学
材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快 加工处理，如暂不提取，应冰冻保存， 且动物材料则需深度冷冻保存：
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精品医学
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎 后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分 在细胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
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提取液
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精品医学
3.生物大分子的提取（抽提）
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎 的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分 地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态 不丢失生物活性的过程。
酶的定位不同，其提纯难度也不相同
“固相转入液相”，或“从细胞内的生理状况转
入外界特定的溶液中”。 —— 相似相溶
免局部过酸或过碱
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精品医学
(3)变性剂的使用
如：脲、胍等 膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等 有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解 去除变性剂，又可恢复原来构象
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精品医学
典型的抽提液组成
离子强度调节剂：蔗糖、KCl、NaCl等 pH缓冲剂：各种缓冲液 温度效应剂：DMSO、甘油 蛋白酶抑制剂：PMSF、亮肽素 抗氧化剂:DTT,巯基乙醇 重金属络合剂：EDTA 增溶剂：Triton-100
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精品医学
选用技术前，需考虑：
1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质 2.酶分子和杂质的主要性质差异 3.酶的使用目的和要求 4.技术实施的难易程度 5.分离成本的高低 6.是否造成环境污染
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精品医学
不同酶的分离、提纯方法，主要根据：
酶分子之间各种选择性的差异 分子大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸收性质 对其他分子的生物学亲和力