叶绿体中Calvin循环多酶复合体可溶性酶组合成多酶复合体的优势及其与类囊体膜的结合对Calvin循环多酶复合体的研究进展作了介绍.关键词:Calvin循环;多酶复合体;类囊体膜以往的研究认为,细胞及其细胞器内充满了游离分子,精确的化学反应是通过这些游离分子的非目的性碰撞而发生的,但现代科学家们对这个观点提出了质疑.目前,根据蛋白质浓度,蛋白质在胞液中的溶解能力,酶一酶之间的相互作用提出:代谢途径的酶在体内应该以复合体的形式存在,并且这种复合体与亚细胞结构和生物膜相结合,为”底物穿梭”提供更加便利的通道,继而提高体内蛋白拥挤的环境中的代谢效率(Srere1987).尽管可溶性酶的组合在蛋白质拥挤的环境中有显着的生理作用,但是用生物化学和分子生物学的技术证明这种观点是非常困难的,因此这种复合体的形成及其代谢重要性遂成为争论的主题.一些动物和微生物细胞中的多酶复合体己有广泛研究(Srere1980;Ovadi1988;Keleti等1989),但关于植物代谢途径中酶的组合信息则很有限(Hrazdina和Jensen1992),且大多数集中于电子传递链组分的研究.植物生物化学研究的目的之一就是提高植物体中代谢的效率,其中也包括作物的光合作用,因此了解体内这种多分子组合及其对代谢途径的调控就非常重要.本文对叶绿体基质中可溶性酶之间组合成多酶复合体以及可溶性酶与类囊体膜结合的研究进展作介绍.1Calvin循环.Calvin循环利用光合作用原初反应和氧释放,光合磷酸化以及电子传递的反应产物ATP和NADPH,将活跃的化学能转换为贮存在糖类中的稳定的化学能,以供给生命活动的需要,即碳同化.这个循环在叶绿体基质中进行,需要11种酶来催化13个连续的反应,分为3个阶段,即羧化阶段,还原阶段和更新阶段,具体的反应过I程如图l..长期以来一直认为Calvin循环中的各个酶都图lCalvin循环【根据Raines(2003)略加修改】A:l,5一二磷酸核酮糖羧化酶,加氧酶(Rubisco);B:3一磷酸甘油酸激酶(PGK);C:3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH);D:丙糖磷酸异构酶(TPI);E:醛缩酶(aldolase):F:果糖.1,6.二磷酸磷酸酶(FBPase);G:转酮酶(transketolase);H:景天庚酮糖一l,7二磷酸酶(SBPase);I:核酮糖.5一磷酸差向异构酶(Ru.5一Pepimerase);J:核糖磷酸异构酶(RPI);K:磷酸核酮糖激酶(RPK).3一PGA:3一磷酸甘油酸:1,3一PGA:1,3-二磷酸甘油酸:G.3一P:3一磷酸甘油醛:DHAp:二羟丙酮磷酸;Fru—l,6一P:果糖一l,6.二磷酸;Fru一6-P:果糖.6.磷酸;E.4一P:赤藓糖一4.磷酸;Sed—l,7-P:景天庚酮糖.1.7.二磷酸;Sed一7一P:景天庚酮糖一7一磷酸;R一5一P:核糖一5一磷酸;x. 5一P:木酮糖一5一磷酸;Ru一5一P:核酮糖.5一磷酸;Ru.1.5.P:核酮糖一l,5一二磷酸.收稿2007—12—07修定2008—04—10资助南京农业大学科技创新基金(Y200523.通讯作者(E—mail:************.cn;Tel:025.84395423,.植物生理学通讯第44卷第3期,2008年6月393是以可溶性状态游离存在于高等植物叶绿体中的,直到上个世纪60年代,Calvin循环中的酶相互结合形成多酶复合体才被发现(vanNoort和Wildman1964;Mendiola和Akazawa1964).目前,许多实验室已经从叶绿体中分离纯化得~lJCalvin循环一些酶组成的多酶复合体.2多酶复合体的分离与特性MUller(1972)认为一些CO,固定酶可能是以一种易解离的复合体形式存在的,但是一般可溶性酶之间的相互作用是弱而短暂的,因此它们的多分子组合的研究比较难,尽管有人曾用不同的手段观察到了Calvin循环酶之间的多酶组合.Sainis和Harris(1986,1987)根据蔗糖密度梯度离心分离得到的豌豆和菠菜叶绿体基质提取物中,1,5一二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco,EC4.1.1.39)组分可以核糖一5一磷酸(R一5一P)为底物表现出依赖ATP的羧化活性,这表明核糖磷酸异构酶(RPI,EC5.3.1.6),磷酸核酮糖激酶(RPK,EC2.7.1.19)与Rubisco可以作为一个整体而纯化出来,后又发现几乎所有RPK都可与羧化酶结合.Gontero等(1988)用离子交换层析,分子筛层析和羟基磷灰石柱层析方法从菠菜中纯化出一个由5个酶组成的复合体,这些酶是卡尔文循环过程中的连续酶,包括RPI,RPK,Rubisco,3一磷酸甘油酸激酶(PGK,EC2.7.2.3)和3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,EC1.2.1.13),这个复合体的分子量为540kDa.由这5个酶组成的复合体催化的反应过程如下:核糖一5一磷酸垦核酮糖一5一磷酸垦坚核酮糖一1,5一二磷酸生!!.3一磷酸甘油酸1,3一二磷酸甘油酸GAPDH3一磷酸甘油醛+NAD++HPO Babadzhanova等(2002)在棉花叶片中也分离得到包括这5个酶的多酶复合体,此种复合体分为游离的和类囊体膜结合的两种形式,分子量分别为(520~20)kDa和(640~25)kDa.2006年他们(Babadzhanova等2006)又在生长15~25d(6～8真叶阶段,花芽形成期间,开花期间)的棉花叶片中分离出分子量分别为(240~lO)kDa和(520~20) kDa的游离多酶复合体,并对发育过程中的RPI, RPK和Rubisco的活性变化进行了比较研究,结果表明多酶复合体中的RPI和RPK与单一酶相比活性变化不显着,Rubisco活性变化显着,生殖器官形成阶段复合体酶活性和光合速率最高.Rault等(1993)研究由这5个酶组成的复合体的结构和功能特性的结果表明,此种复合体中每一酶组分的四级结构都不同于游离的单一酶的四级结构,其动力学研究(Gontero等1993)结果表明,复合体中的酶有较高的和较低的rm.Ricard等(1994)提出,不同的酶组合成多酶复合体后其催化特性发生变化,这种变化与不同活化位点之间的反应中间产物通道无关,而是多酶复合体中酶彼此之间信息传递的结果(RiCard等1994; Gontero等1994).迄今研究较多的是由GAPDH和RPK组成的多酶复合体,这2个酶在Calvin循环过程中催化不连续的反应,但也可以结合成为复合体而存在. Nicholson等(1987)在斜生栅列藻(Scenedesrnus obliquus)中分离得到一个稳定的含有GAPDH和RPK的复合体,分子量为560kDa,这2个酶呈结合状态,彼此之间的动力学特性相互影响.在衣藻(Chlamydomonsreinhardtii)的叶绿体中也分离和纯化出一个含有RPK和GAPDH的双酶复合体(Lebreton等1997;Avilan等1997),热力学统计的结果表明其蛋白之间有信息和能量传递.复合体的稳定或不稳定是通过构象变化来反映的,而这种构象变化则是通过蛋白质一蛋白质的相互作用表现出来,最终各组分之间产生互相结合的指纹.构象变化的热力学研究表明GAPDH和RPK即使在分离之后仍然携带有这些指纹,最终引起一些辅助因子的动力学特性发生变化(Lebreton等1997;Avilan等1997;Lebreton和Gontero1999; Graciet等2002).Mouche等(2002)采用多重技术相结合的方法研究衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中GAPDH和RPK组成的多酶复合体的结果表明, 二聚体的RPK在与四聚体的GAPDH结合和分离的循环过程中的活性有显着变化;低温电子显微镜观察表明分离的和模型化的RPK二聚体和整个复合体的三维结构的对应体之间在结构上有显着变化.RPK与GAPDH之间相互结合,并可以利用原初反应和氧释放,光合磷酸化和电子传递反应中产生的ATP和NADPH,此种双酶复合体中2个酶之间相互协同调控,定义为一个”控制单位”——Calvin循环是光,pH和代谢物调控的一个起始点.因此认为,RPK与GAPDH之间的蛋白质一394植物生理学通讯第44卷第3期,2008年6月蛋白质相互作用可更好地调控Calvin循环(Lebreton 和Gontero1999).近2年来还发现,GAPDH和RPK组成的多酶复合体还可与CP12共同组成一个多酶复合体, CP12是一个核基因编码的分子量为8.5kDa的叶绿体蛋白,在超分子复合体装配中起蛋白连接子的作用(Graciet等2003),GAPDH,RPK和CPI2的组装模型如图2所示,首先GAPDH与CP12相互结合,解离常数接近0.44nmo1.L～,这种结合可能使GAPDH构象发生改变,而后GAPDH/CP12复合体与RPK相互结合,其解离常数为60nmo1.L-, 最终形成半个复合体,定义为一个单位.这个单位以二聚体形式最终形成包括2个二聚体的RPK,2个四聚体的GAPDH,可能是2个单体CP12的复合体.Graciet等(2004)曾对GAPDH/CP12/RPK组成的复合体的动力学,调控特性及其在CO同化中的作用作了详细综述.Marri等(2005)也曾对拟南芥进行体外重组得到GAPDH/cP12/RPK相互结合的复合体,其分子量为640kDa.图2衣藻(Creinhardtii)的GAPDH,RPl(/CP12复合体组装模型【根据Graciet等(2003)略加修改】除了由5个酶和2个酶组成的多酶复合体之外,人们还发现了由其他不同酶组分组成的Calvin循环多酶复合体.Persson和Johansson (1989)用液体两相系统的逆流分配探测6个Calvin 循环酶的共分配现象的结果表明这些酶之间存在蛋白质.蛋白质复合体趋势,这些酶包括Rubisco, PGK,GAPDH,丙糖磷酸异构酶(TPI,EC5.3.1.1),醛缩酶,果糖.1,6.二磷酸磷酸酶(FBPase,EC3.1.3.11).Siiss等(1993)分离出一个含有RPI,RPK,Rubisco,GAPDH,景天庚酮糖.1,7一二磷酸酶(SBPase,EC3.1.3.37),铁氧还蛋白NADP还原酶(FNR,EC1.18.1.1)的多酶复合体,其分子量为900kDa.这一复合体在低离子强度溶液中比较稳定,Calvin循环酶形成催化链,以5.磷酸核糖为底物,经过多步连续酶促反应合成3.磷酸甘油酸,这种”底物穿梭”可大幅度的增加催化效率.Jebanathirajah和Coleman(1998)用快速蛋白液相色谱(fastproteinliquidchromatography, FPLC),从烟草叶绿体中分离得到碳酸酐酶(CA, EC4.2.1.1)与Rubisco,RPK,RPI相结合的多酶复合体,其分子量高于600kDa,CA可能与Rubisco 结合在卡尔文循环多酶复合体的外侧,RPK位于复合体中心,并与类囊体膜结合.总之,这些体外研究的结果表明,大部分参与Calvin循环的酶均可以结合成为多酶复合体,但不同复合体之间的酶组分则不完全相同,酶组分之间没有确定的化学计量比(表1).Rault等(1993)采用免疫化学和光密度分析相结合的方法研究由RPI,RPK,Rubisco,PGK和GAPDH组成的多酶复合体中酶组分的化学计量比时发现,多酶复合体含有RPK的2个亚基,RPI的2个亚基,Rubisco的2个大亚基(L)和4个小亚基(S), PGK的1个亚基,GAPDH的2个不同的亚基(0’亚基和B亚基).Hosur等(1分析多.993)Rubisco/RPK酶复合体的结晶和结构时,发现Rubisco是正常的S.形式,但对其中一些晶体进行X.ray衍射的结果表明,晶体Rubisco除正常LS形式之外还有其他的形式,如上面所说的LS韵形式,这可能是多酶复合体中其他酶影响造成的.根据不同实验室的结果可以认为,其原因可能是采用的提取和纯化程序不同造成的,也可能是多分子之间结合的松紧程度不同和动态变化造成的.体内由基质酶和膜结合的酶组成的蛋白复合体可能是蛋白网络排列的,而不是按单个酶组分”无秩序的”随机分布排列的,因此溶解于水介质中时的多酶复合体会趋向解离,各组分分开,只有非常稳定的酶复合体在提取之后才有可能在非生理的液相环境中仍然保持结合状态,分离出来可用于特征研究,否则就难以确定多酶复合体中酶组分的化学计量比.另外,分离Calvin循环中酶复合体时也不能排除实验操作过程中由于人为因素而引起部分游离植物生理学通讯第44卷第3期,2008年6月395 酶自由组合成多酶复合体,应该采用灵敏度高的检测方法证明新鲜细胞器提取物中的酶是聚合成复合体而不是人为因素造成的.Stiss等(1993)用限制性蛋白酶水解和免疫印迹相结合的方法证实了这一点.这个方法是建立在Lys和Arg残基通常参与寡聚蛋白蛋白交界面形成的基础之上的.如果能够切割这2种氨基酸的肽键进而使蛋白组分分开,则所有的样品都可在同一介质中进行蛋白酶水解,反过来,特定酶需要具有同一构型;与单一酶相比,多肽的差异应该是由蛋白质.蛋白质之间的相互作用引起的.单独的酶可能更容易受到特异性蛋白酶的影响和裂解,而如果这些组分结合到多酶系统中就不易受蛋白酶水解的影响. 经证明,专一的裂解精氨酸和赖氨酸残基的胰蛋白酶是这～实验中的常用品,有人用胰蛋白酶已成功证明IK和GAPDH在新鲜准备的基质提取物中是相互结合的.此外,在不同离子强度下Calvin循环酶复合体的解离也可采用这种技术加以证明(Stiss等1993).从这些结果中还可以看出,基质提取物的任何处理都可能引起Calvin循环多酶复合体的解离,这就可以解释为什么从同样的提取物中分离的Calvin循环多酶复合体有组分的差异和分子量高低之分.如同Calvin循环一样,其他代谢途径的连续酶也可以在叶绿体中结合成为多酶复合体,这样所有代谢反应才可以在一个协调的环境中进行,光反应也才可以更有效地利用能量,产生还原力,有关其他代谢途径中酶组合的信息尚少,还有待继续研究.3可溶性酶组合成多酶复合体的优势及其与类囊体膜的结合植物体内的一些代谢途径可以共享同样的代谢中间产物,并同时在特定的时间内于拥挤的环境中进行,因此将酶之间代谢途径的细微区域化与底物通道连接起来研究是非常必要的,这就可以将这些代谢途径的共同底物和辅助因子之间的竞争降到最低,代谢过程得以有效进行.SnSS等(1993)提出,多酶组合能够使CO,同化所需组分和辅助因子(A TP和NADPH)更加便利的运输到催化位点,还可以防止其他代谢途径的干扰.Rault等(1993)研究RPI,RPK,RubiSCO,PGK和GAPDH构成的复合体的动力学结果表明, Rubisco以复合体形式存在时,其催化效率提高,这可能是每一活化位点的.增加和下降造成的.Sainis和Jawali(1994)在体外观察到,由RPI,RPK,Rubisco组成的Calvin循环多酶复合体可以表现出以R.5.P为底物和依赖ATP的CO,固定活性,可为中间代谢物提供通道,致使Rubisco的催化反应更加便利.PGK和GAPDH在体外的相互结合表明二者之间可以相互作用,并可为l,3.二磷酸甘油酸的穿梭提供通道(Wang等1996).Brenda(2004)认为,酶结合成复合体后的最大优势就是可使一些生物合成的代谢中间产物更加便利的运输到催化位点,而不是在细胞内聚成团,这种代谢通道在提高和调控细胞的生物化396植物生理学通讯第44卷第3期,2008年6月学反应中发挥作用.一般,多酶复合体可以为“底物穿梭”提供更加便利的通道,从而提高酶催化效率,同时还可增加酶结构的稳定性,其在体内蛋白质拥挤的环境中的优势更明显.除了可溶性酶之间可以相互作用结合成复合体以外,可溶性酶还可与类囊体膜结合.已有的研究表明,Rubisco,FBPase,RPK,GAPDH,PGK和RPI可结合在类囊体膜上(Mori等1984; Hermoso等1989;Sainis和Melzer2005),I-I+一ATP 合酶可以为Rubisco提供膜结合位点(Sainis和Melzer2005).但实验过程中由于一些人工操作所引起的酶吸附在类囊体膜上的假象不能被排除,这一问题己可以通过低温固定叶切片和免疫电镜加以解决.早期的免疫化学研究表明,Rubisco分子随机分布在叶绿体基质中(Shaw和Henwood 1985;V aughn1987),其他的卡尔文循环酶也是均匀分布的,但有人用免疫电镜研究的结果对此种假设提出了质疑,发现卡尔文循环中的酶,如:RPK,GAPDH和SBPase都结合在类囊体膜上(Stiss等1993).此外,还有人发现微藻中的RPK 也结合在类囊体膜上(Mangeney等1987),更有人发现FBPase和硫氧还蛋白也结合在类囊体膜上(Hermoso等1992).在衣藻的叶绿体中用免疫电镜可以观察到Calvin循环酶,如RPI,GAPDH, FBPase,醛缩酶和PGK在体内均与类囊体膜结合(SUss等1995).豌豆叶片的免疫定位观察表明, 60%的GAPDH和54%的PGK结合于类囊体膜上(Wang等1996).而Anderson等(1996)对豌豆叶片进行免疫定位后发现大部分的PGK,SBPase,一半的GAPDH,RPK,小部分的TPI,醛缩酶,CA都是与类囊体膜结合的.此外Teige等(1998)报道Calvin循环中的一些次要酶类型,如:核酮糖一5一磷酸差向异构酶,转酮酶也都结合在类囊体膜上. FNR可与包括GAPDH在内的Calvin循环多酶复合体一同分离得~U(SUss等1993),它也是与类囊体膜结合的电子传递链的组分之一,因此推测PSI和Calvin循环之间有密切关系.GAPDH是卡尔文循环中唯一依赖NAPDH的酶,但在基质提取物的免疫亲和层析中用抗FNR和抗GAPDH的抗体的结果表明二者是相互结合的(Sainis和Melzer 2005).PSI的E亚基是FNR在类囊体膜上的主要结合位点(Andersen等1992).这表明FNR的功能并不是简单的作为Calvin循环多酶复合体到PSI之间的膜连接器,FNR与GAPDH的结合可以认为是NADP/NADPH的通道,这样光反应产生的还原力NADPH就可更加便利的运输到暗反应,提高光合速率.总之,根据前人的研究可以推断,多酶复合体与类囊体膜结合可以使膜上的代谢物通道更加通畅,各类代谢途径可以互相连接,同时还可以用以解释高等植物中有效的光合电子传递和CO:固定之间的耦联.此外,非液相介质可以显着增加可溶性酶的稳定性和周转数量,酶与膜结合后会限制水在酶层中的分布,并在催化位点上产生一个非极性的环境,从而促使酶的稳定性和周转数量增加,进而更加便利的发挥其催化作用.酶与膜结合还可以延长酶的寿命,二者结合后可以阻止酶聚集和钝化(Bell等1995),因此,Calvin循环酶与类囊体膜结合的研究是有意义的.4结语Calvin循环在植物合成代谢中是一个独特的过程,在CO,同化中起作用,它与绿色植物,藻类和光合细菌的生物量和产量,温室气体减少等有着密切的联系.迄今对Calvin循环个体酶的研究比较多,长期以来一直认为Rubisco是这一途径的限速酶(Man1999),因此,对Rubisco在蛋白和基因水平上做了大量研究(Spreitzer和Salvucci2002).但Quick等(1992)对Rubisco是限速酶这一概念提出了质疑,Raines(2003)对Calvin循环的综述中也表明在各种环境条件下,Rubisco对碳固定的影响很小,FBPase,RPK,GAPDH,醛缩酶和转酮酶却有着不可忽视的作用,而SBPase是Calvin循环的限速酶,并且要更加重视对酶复合体的研究,特别是关于复合体中酶活性调控的机制的研究.因此这就要求我们重新考虑代谢途径的控制是否还将仍然停留在代谢途径单个酶的活性上..尽管Calvin—Benson循环多酶复合体已经得到证实,但仍有很多问题没有解决.首先是各个实验室得到的多酶复合体的组成有差异,不仅表现在不同物种上,同一物种之间也有很大的差异,这些差异需要用更多的材料作实验,这样才可在更大范围的高等植物叶绿体中进行比较,验证其普遍性;其次是揭示多酶复合体的空间结构特植物生理学通讯第4卷第3期,2008年6月397点,即各个酶是如何组装的,哪个酶在复合体的内部,哪个酶在复合体的外部,它们是如何相互作用的,其超分子的空间结构又是如何,迄今这方面的报道还很少,只有一些结构模型的猜想(图2),因此这也是未来研究Calvin循环多酶复合体可能要解决的问题;最后也是最本质的问题是多酶复合体的生理意义和其结构功能的研究,其目的都是为了揭示多酶复合体在生物体内的作用.因此在光合作用机制和蛋白质结构的研究中,多酶复合体的相互结合,并能表现出各个酶的催化活性的探讨,无论是在体内或是体外进行验证都有意义.参考文献AndersenB,SchellerHV,Moiler—LindbergB(1992).ThePSI—E subunitofPhotosYstemIbindsferredoxin:NADP oxidoreductase.FEBSLett.3ll:l69~l73?AndersonLE,GibbonsJT,WangXW(1996).Distributionoften enzymesofcarbonmetabolisminpea(Pisurnsativurn) chloroplasts.IntJPlantSci.157:525~538AvilanL,GonteroB,LebretonS,RicardJ(1997).Information transferinmultienzymecomplexes.2.TheroleofArg64of Chlarnydornonasreinhardtiiphosphoribulokinaseinthein—formationtransferbetweenglyceraldehydes一3一phosphatede—hydrogenaseandphosphoribu1okinase.EurJBiochem,250: 296～302BabadzhanovaMP,BabadzhanovaMA,AlievKA(2002).Freeand membrane—boundmultienzymecomplexeswithcalvincycle activitiesincottonleaves.RUSSJPlantPhysiol.49:592~597 BabadzhanovaMP,BabadzhanovaMA,AlievKA(2006).Devel—opmentalchangesintheactivitiesofenzymesoffreemul—tienzymecomplexesinvolvedintheBenson.Calvincycle. 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