在苯基键合固定相微型柱上儿茶酚胺的反相离子对色谱的研究

收继续使用。（三）两种异构体的定量分析：从表２所列两种异构体的定量分析结果可见，对不

同比例的异构体（组分Ⅰ的含量从９６．６７％到４．５１％），其定量分析标准偏差都小于

０．４％两种不同流动相的分析结果非常接近。０．２微克的样品１０分钟内可给出准确的结

果。（四）小结：消旋的７５０３醇和光学纯的（＋）或（－）的α－异丙基－４－氯苯乙酸

反应，生成非对映异构体的酯，再用高效液相色谱分离。此法可用于这种光学异构体的

定量分析和大量制备。

致谢：医科院药物所姜振哲和王津生同志协助做制备。环化所王孝明和孙思恩同志

协助做质谱分析，特此致谢。

参考文献

〔１〕中国科学院动物研究所药剂毒理室，昆虫学报，２２，３９０（１９７９）〔２〕Ｔｈｏｍａｓ　ｃｈｍｉｄｆ ｔ ｌ．，ｒｆ，１，５５１，５４８（１９７６）󰀀．分〔３〕Ｗ．Ｄｉｅｔｅｒｌｅ，󰀀Ｃｒｏｍ ａｏｇｒ．，２２，２８９（１９８２）󰀀；５９，３１（󰀀１９３）󰀀．󰀀󰀀〔４〕Ｊｏｈｎ　Ａ．ｈｏｍｐｓｏｎ ａ，Ｉｂｄ２３８，４７０（１９８２）．󰀀󰀀󰀀〔５〕Ｔｏｍ　ｏｚｏｈ　Ｔａｍｅｇａｉ　ｅｔ　ａｌ．，ｉｄ，１９．４８３９８０）．󰀀产󰀀品〔󰀀６〕Ｍａｓｓａｏ　Ｈｏｒｉｂａ　ｅｔ　ａｌ．，ｒｉｃ．瓸Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，󰀀１６１（１９８０）．󰀀〔７〕郑如玉等，色谱，１，４０（１９８４）．（收稿日期：１９８５年６月１７日）

在苯基键合固定相微型柱上儿茶酚胺的

反相离子对色谱的研究

邹公伟史蓉蓉高鸿

（南京大学化学系

〔提要〕本文应用微型高效液体色谱—电化学检测Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ—ＥＣＤ）的

方法，进行了在苯基键合固定相微型柱上，用反相离子对色谱分离儿茶酚胺ＣＡ）的研究。

用流动伏安法确定了薄层池安培检测器的实验条件。比较了十八烷基键合固定相（ＹＷＧ

Ｃ１８Ｈ３７、阳离子交换剂（Ｐａｒｔｉｓｉｉ－ＳＣＸ）和苯基键合固定相（ＹＷＧＣ６Ｈ５）柱上ＣＡ的

色谱行为，讨论了ＹＷＧＣ６Ｈ柱上，流动相ｐＨ的变化对ＣＡ分离的影响，确定了应用Ｍｉｃｒｏ

ＨＰＬＣ－ＥＣＤ方法，在ＹＷＧＣ６Ｈ５柱上，用１－庚烷磺酸钠作为离子对试剂，分离ＣＡ的实

验条件。

反相离子对色谱法逐渐成为ＣＡ测定的主要方法，大部分文献报道了ＣＡ在十八烷基键合固定相上的分离〔１－８〕。尽管使用苯基键合固定相的分离文献报道较少〔９〕，但从

理论的观点来看，它对ＣＡ等具有极性的非同系物，且官能团有差异的化合物的分离，可

望得到更高的选择性、更好的峰形和分离度。本文应用Ｍｉｃｒｏ　Ｈ

ＰＬＣ－ＥＣＤ实验技术，研究了各种类型固定相对ＣＡ分离的影响，讨论了苯基键合固定相反相离子对色谱体系

流动相对ＣＡ分离的影响，确定了使用苯基键合固定相分离ＣＡ的实验条件。

实验部分

仪器：使用的Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ－ＥＣＤ装置如文献〔１〕报道。定量输液器（Ｍｉｃｒｏｆｅｅ－

ｄｅｒ，　Ａｚｕｍａ　Ｄｅｎｋｉ　Ｃｏ，　Ｍｏｄｅｌ　ＭＦ－２）和微量注射器（Ｍｉｃｒｏｓｙｒｉｎｇｅ，Ｔｅｒｕｍｏ

Ｃｏ，Ｍｏｄｅｌ　ＣＡＮ－１．００）用来供给流动相，ＸＪＰ－２新极谱仪（江苏电分析仪器厂）

用来控制工作电极的电位和测量电解电流。ＸＷＴ自动台式平衡记录仪（上海大华仪表

厂）作出电流－时间图。分离柱、贮液管和连接管均为聚四氟乙烯管，管间由不锈钢管

连接。流动薄层池安培检测器的薄层池池腔系将一块氟碳树脂块和一块有机玻璃块紧压

一片开有长１厘米、宽２毫米沟的聚四氟乙烯薄膜构成。薄膜厚度为３０微米时，池腔体

积约０．２微升。与色谱柱的连接口和流经池的溶液出口设在上方的有机玻璃块上。将直

径３毫米的玻璃碳园盘嵌在下方氟碳树脂块上作为工作电极，其表面与树脂块一起抛光

成光洁的平面。参比电极系Ａｇ／ＡｇＣｌ，安装在柱出口外上方，由一根聚四氟乙烯管与出

口相连接。作为辅助电极的不锈钢管，安装在Ａｇ／ＡｇＣｌ电极旁的液体出口处，兼作溶

液流出导管。

试剂：去甲肾上腺素（ＮＡ，Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ），肾上腺素（ＡＤ，Ａｄｒｅｎａ－

ｌｉｎｅ，　Ｓｅｒｖｅ），左旋多巴（Ｌ－ＤＯＰＡ，上海第一医学院），多巴胺（ＤＡ，使用上海第

十制药厂产３－羟酪胺注射液代替），Ｈ３ＰＯ４、ＮａＯＨ、ＥＤＴＡ和ＫＨ２ＰＯ４均为分析纯

１－庚烷磺酸钠和１－戊烷磺酸钠（人民解放军军事医学科学院），ＹＷＧ　Ｃ６Ｈ５和ＹＷＧ

Ｃ１８Ｈ３７（１０微米，天津化学试剂二厂），Ｐａｒｔｉｓｉｌ－ＳＣＸ（１０微米，Ｗｈａｔｍａｎ），ＹＷＧ

８０（１０微米，青岛海洋化工厂），电极表面抛光剂为０．０５微米氧化铝，溶液配制均使用

亚沸蒸馏水。

操作步骤：手动操作微量输液器，将流动相经由贮液管吸入微量注射器，再吸入一

定量样品溶液，接上分离柱，启动微量输液器，流动相带着样品以一定流速流经柱后进

入薄层池检测器，在有一定电压的工作电极上测得氧化电流，在记录仪上得到电流响应

和时间关系的色谱图。

结果和讨论

（一）电化学检测实验条件的确定：在ＹＷＧ　Ｃ６Ｈ５柱上，改变电化学检测器的工

作电位，按前述操作步骤得到ＣＡ的色谱图。由流动伏安法则得的峰电流－电位曲线示

于图１，对于Ｌ－ＤＯＰＡ在＋０．７５伏（ＶＳ．Ａｇ／ＡｇＣＩ）电位处获得最大氧化电流，而

ＮＡ、ＡＤ和ＤＡ在＋０．７０伏（ＶＳ．Ａｇ／ＡｇＣｌ电位左右达电流极限，最适工作电位选

择在＋０．７５伏（ＶＳ・Ａｇ／ＡｇＣｌ）。

（二）Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ－ＥＣＤ体系色谱保留值再现性试验：

Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ可采用简单的停流进样方式。表１列出了十次试验结果，溶剂峰和ＣＡ的保留时间具有良好的再现性。以Ｌ－ＤＯＰＡ为例，进样体积为２．４微升时，保

留体积为５０．６微升，峰展宽的体积为８．

８微升，理论塔板高度为０．１毫米。Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ停流进样保留时间的再现性表１

（三）在装有不同填充剂的微型柱上ＣＡ的色谱行为的研究：

Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ所用分离柱内径为０．２５～󰀀０．５毫米，所用填充剂仅为ＨＰＬＣ（内径

２～５毫米）的百分之一，耗价低，可手工充填，使用聚四氟乙烯管作分离柱，增加了

体系的耐腐蚀性能，柱长度的改变和柱的更换操作简便。因此，用Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ分离

柱来研究填充剂特性具有实用价值。

表２列出了ＣＡ在不同填充柱上的容量因子Ｋ＇

值表明苯基键合固定相柱极性稍强于十八烷基固定相，与Ｈｏｒｖａｔｈ曾指出的其保留的强弱相当于辛烷基键合固定相相符〔１１〕

不同填充柱上ＣＡ的容量因子Ｋ表２

图２为ＣＡ在上述三色谱柱上获得的色谱图实例。由于ＡＤ和ＤＡ具有极性且官能团上

有差异，它们在与Ｃ１８Ｈ４７－的作用力相差不大而分离情况不佳，且保留时间太长（如ＡＤ

达３６分２０秒）。在ＹＷＧＣ６Ｈ５柱上，由于苯环的π校－π键相互作用和各ＣＡ结构上的差

异，如ＮＡ与ＡＤ在β－碳上含有－ＯＨ，　Ｌ－ＤＯＰＡ和ＤＡ则不含－ＯＨ，且Ｌ－ＤＯＰＡ还含

有α－羟基，形成π󰀀－ＯＨ作用，使Ｌ－ＤＯＰＡ与ＮＡ、ＡＤ与ＤＡ在Ｃ６Ｈ５－上的作用力显示差

异，其结果是在本文所用流动相的固定条件下，ＹＷＧＣ１８Ｈ３柱上不能完全分离的Ｌ－

ＤＯＰＡ与ＮＡ和完全重叠的ＡＤ与ＤＡ峰，在ＹＷＧＣ６Ｈ５柱上得到了完好的分离。至于Ｐａｒｔｉｓｉ１－ＳＣＸ柱，保留机理不同于其他二色谱柱，主要是由各组分溶剂化离子与交换树

脂亲和力大小决定的，Ｌ－ＤＯＰＡ和ＮＡ之间亲和力相差较大，ＡＤ和ＤＡ亲和力几乎相等由图２可得到证实。关于ＣＡ的分离，早期多采用阳离子交换树脂〔１２．１３，目前众多的

研究者使用十八烷基键合固定相，本实验的结果表明，使用苯基键合固定相进行ＣＡ的

反相离子对色谱分离，在分离度、选择性和峰形等方面都比十八烷基固定相和阳离子交

换树脂好。

（四）ＹＷＧＣ６Ｈ５柱上流动相ｐＨ变化对ＣＡ分离的影响从ＣＡ的结构可知它们都含有可质子化的官能团－ＮＨ２基，属有机碱类，ＣＡ的结

构式和在水中的质子解离平衡常数列于表３。ＣＡ的结构式和离解常数〔１〕表３

在ＹＷＧＣ６Ｈ５柱上用１－庚烷磺酸钠

的磷酸盐缓冲溶液为流动相，ＣＡ的ｌｏｇｋ＇

值随ｐＨ变化的关系示于图３。Ｌ－ＤＯＰＡ

既有氨基又在氨󰀀的α－碳位含有羧基，具有

两性，保留行为表现出特殊性，离子对试剂

的影响较小、在ｐＨ１．Ｒ时．ｐＨ＜ｐＫ１（ｐＫ１＝２．

３２），羧基的离解受到抑制，氨基却几乎完全质子化，与反离子形成离子对的趋势增大，因而具有较大的ｌｏｇｋ＇，在ＮＡ后面

出峰。ｐＨ＞ｐＫ１后，羧基逐渐离解而氨基质子化趋势减小，致使ｌｏｇｋ＇减小，在ｐＨ４．２

左右，ｋ＇值大致不变，此时羧基的离解和氨基的质子化趋势大致相同。就ＮＡ、ＡＤ

和ＤＡ的情况而言，ｌｏｇｋ＇随ｐＨ变化情况相同。ＰＨ３．５处ｌｏｇｋ＇出现最低点，并影响ｌｏｇｋ＇

与ｐＨ关系曲线的形状。为了解释这个事实，在保留作用极小的ＹＷＧ８０柱上测定峰电

流值随ｐＨ值的变化，ｐＨ３．５时，电流响应值最低，初步可推定出现了某种异常现象，

如化合物形态的改变等，本文不再进一步讨论。众所周知，十八烷基键合固定相柱上反相离子对色谱分离有机碱时，加入烷基磺酸，ｌｏｇｋ＇随ｐＨ的增加而减小。卢佩章〔１６〕报

告了在没有离子对试剂存在时，十六烷基柱上的反相色谱中，ＮＡ、ＡＤ和ＤＡ等有

机碱的ｌｏｇｋ＇值随ｐＨ增加而增加的趋势，并说明其原因为氨基的质子化随ＰＨ值增大而

逐步受到抑制，疏水性增强，ｋ＇增加。本文的实验结果与卢佩章的结果一致，由于苯

基与十六烷基和十八烷基的极性，结构特性等存在差异，苯基柱的反相离子对色谱中ｐＨ

的影响更为复杂，有待进一步研究。

（五）离子对试剂浓度对ＣＡ分离的影响

图４所示ｋ＇与离子对试剂浓度的关系表明，由于化合物结构上的差异，离子对试剂浓度对ｋ＇值的影响因物质而异。Ｌ－ＤＯＰＡ中羧基的存在影响氨基的质子化，在

流动相ｐＨ为４．２时，羧基离解度较大，氨基质子化受到抑制，所以离子对试剂浓度的变

化对ｋ＇的影响不大，ｋ＇与试剂浓度的增加呈一平坦的直线上升关系。而对ＮＡ、ＡＤ和

ＤＡ来说，ｋ＇值随１－庚烷磺酸钠浓度的增加上升加快，到２．５ｍＭ后变化事况有所改变。

总观全图，１．５ｍＭ１－庚烷磺酸钠时各ＣＡ的ｋ＇值较适宜于实际分离。

（六）ＣＡ色谱分离的条件

根据前述实验结果，我们拟定了Ｍｉｃｒｏ　ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法在苯基键合固定相上分离ＣＡ

的实验条件为：流动相：５０ｍＭＫＨ２ＰＯ

４（ｐＨ４．２），含１．５ｍＭ１－庚烷磺酸钠和０．１ｍＭ