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原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
·综述·焦磷酸测序技术及其应用进展倪红兵综述 鞠少卿 王惠民审校 【摘要】 焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DN A序列分析的技术。
在DN A聚合酶、A T P硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dN T P聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DN A序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。
【关键词】 焦磷酸测序技术; 单核苷酸多态性; DN A序列分析 DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,而双脱氧核苷酸链终止法(Sange r法)是目前使用得最普遍的DNA序列分析技术。
在基于San-g er法的全自动DNA测序技术中,测序反应产生的DNA片段是荧光标记的,这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离,荧光分子被激发而发光,发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列,且单向反应的读序较长,目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证,而这种分析往往测几十对碱基(beas pair,bp)就可以满足需要。
在这种情况下,Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。
新发展的焦磷酸测序技术(Py rosequencing)应该是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。
焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术,该技术对DNA的序列分析无须进行电泳,DNA片段无须荧光标记,因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置。
本文将就焦磷酸测序技术的原理和应用等方面作一综述。
焦磷酸测序技术1.焦磷酸测序技术的原理:焦磷酸测序技术是由Ronaghi等[1,2]于1987年发展起来的一种新型的DNA测序技术,其核心是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。
焦磷酸测序重亚硫酸盐
焦磷酸测序是一种基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的测序技术。
它是一种混合式测序方法，能对大量DNA片段进行测序。
这种技术基于DNA聚合酶链式反应中两种在一定温度
下互补结合的引物。
在DNA的扩增过程中，链终止核苷酸扣除在内，由于DNA聚合所需要的缺少的单核苷酸，DNA的长度会逐渐增加。
这时，一个还原剂重亚硫酸盐（NaHSO3）被添加到反应体系中，使得终止核苷酸可以被还原。
接下来，热量的作用下，还原后的终止核
苷酸被剥离，使得链的延伸能够再次进行。
在继续塑型过程中，一旦有一种特定的二进制
码序列出现，反应便会停止。
接下来通过比对序列相似度找出二进制码串，即可确定测
序的结果。
而重亚硫酸盐（NaHSO3）是一种常用的化学剂，用于对化合物的还原作用，它的化学
式为Na2S2O5。
它在红倒试验中起到还原Cu2+的作用，以生成Cu2O沉淀。
在焦磷酸测序中，重亚硫酸盐和DNA扩增反应中的核苷酸共同作用，实现可控的DNA延伸和中断。
在焦磷酸测序中，重亚硫酸盐的浓度需要精确控制才能保证测序的准确性。
如果重亚
硫酸盐浓度太高，则会导致DNA链不断断开，因而DNA的延伸被大大限制。
反之，如果重
亚硫酸盐的浓度过低，则会使得扩增过程中的DNA变得过于短小，失去良好的延伸性。
综上所述，重亚硫酸盐在焦磷酸测序反应体系中发挥了关键的作用，它在DNA扩增中
提供了可控的链延伸和中断，从而使得大量基因片段得以测序。
焦磷酸测序技术简介及临床意义
PyrosequencingTM (焦磷酸测序技术)是一种基于4种酶的级联反应来进行定量序列分析的技术。
通过对病人样本DNA序列的直接测定，从而与已知DNA序列进行对照，从而对病人的病情作出判断。
不仅可以指导临床用药，甚至可以对未来的病情发展做出预测。
目前焦磷酸测序技术越来越多的应用在病毒的分型和耐药分析、微生物快速鉴定和肿瘤的个性化治疗中。
与传统的检测方法相比，焦磷酸测序技术由于是直接得到目的核酸片段的序列，所以又被称为分子诊断中的“金标准”。
. 精品 Pyrosequencing技术的原理 Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：
第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
第2步图示(图片来自互联网) 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
第3步图示(图片来自互联网) 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。
第4步图示(图片来自互联网) 第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 .
精品 第4步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。
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具体事例 【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。
【关键词】 序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达 1 引 言 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。
焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。
2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料. 精品 21R型台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR扩增仪、Opticon实时荧光PCR仪(美国MJ Research公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。此装置主要由焦磷酸测序反应模块、荧光信号放大和数据采集3部分组成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管与四周的dNTP储液池相连组成。通过注射器施压使4种dNTP循环加入反应池完成测序反应。荧光信号通过R6335光电倍增管(日本Hamamatsu Photonics K.K.公司)放大后，经BPCL微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。
Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反转录试剂盒(德国Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和5′磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma公司); DynabeadsM280链霉亲和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA 聚合酶(美国Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。
实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。 2.2 RNA的提取 用Trizol试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度。 2.3 反转录合成cDNA第一链 取等量的不同来源的总RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总RNA 0.05～2.0 μg至Nucleasefree的小管中，加DEPCH2O至12 μL;65 ℃反应5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10×第一链合成缓冲液2 μL，0.5 mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L反转录引物，加DEPCH2O至总体积为20 μL。反转录条件为：37 ℃ 反应1 h, 93 ℃反应5 min，然后中止反应。
2.4 基因特异性PCR 不同来源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5′CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。PCR体系为： cDNA等比例混合液1 μL， 0.3 μmol/L CP和GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物，10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液 10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应程序为： 94 ℃ 变性 15 min，热循环35次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )， 72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。基因特异性引物的序列见表1。表1 实验用引物
2.5 焦磷酸测序固相单链模板的制备 取5 μL戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。磁珠以100 μL B&W Buffer(10 mmol/L TrisHCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗涤两遍，最终悬浮于50 μL B&W 缓冲液中;加入50 μL PCR产物，37 ℃反应30 min;用磁铁吸弃上清液，磁珠以180 μL . 精品 H2O洗涤两遍，加入0.1 mol/L NaOH溶液20 μL，混匀室温放置5 min使PCR产物变性;磁铁吸弃上清液，磁珠以100 μL B&W 缓冲液洗涤两遍，100 μL 1×退火缓冲液洗一遍，最终溶于8 μL 1×退火缓冲液中;加入1 μL 10 μmol/L测序引物，.
精品 93 ℃混匀30 s，55 ℃退火3 min，4 ℃保存，待测序用。 2.6 焦磷酸测序反应 焦磷酸测序标准混合液的组成为：0.1 mol/L TrisAc缓冲液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′磷酸化硫酸腺苷(adenosine5′phosphosulfate，APS)，0.4 μg/L PVP，0.4 mmol/L D虫荧光素，2×10-4 U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L无外切酶活性的Klenow DNA聚合酶，14.6 mg/L荧光素酶。
3 结果与讨论 3.1 方法原理 焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。其原理是：引物与模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。产生的荧光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。反应方程式如下：
(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1) PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2) ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3) dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4) ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5) 为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序列进行解码和定量测定。采用反转录引物将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后用焦磷酸测序定量测定标记序列。
具体测定过程如图1所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA进行反转录。引物由4部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的4个碱基为人为设计的来源特异性标签，在图1中以深浅不同的4个小圆点表示;3′端为oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的两个兼并碱基。来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的cDNA稀释后等比例混合;(3) 用生物素标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行任何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR产物制备成单链，根据来源特异性反
