感受态细胞制备和细菌的转化
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感受态细胞制备和细菌的转化
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
(a)从冻存管中挑取细胞在LB培养基平皿上划线接种后过夜培养;
(b)挑取单克隆菌落至5 ml LB培养基中,37℃,220 r/min振荡培养过夜;
(c)把菌液按1:100(视浓度而定)转接入50 ml LB液体培养基内,37℃, 200
r/min培养至OD600≈0.5 (大约3小时),此时菌液呈现半透明、云雾状;
(d)把菌液冰浴冷却10-15 min;
(e)于4 ℃,4000 r/min,离心10 min;收集菌体;
(f)用30 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20
mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀,于冰上操作;
(g) 4 ℃,4000 r/min离心10min;
(h)每50 ml初始培养物用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaC12重悬细胞沉淀;
(i)加入860μl 50%甘油,混匀,按50μl/管分装于1.5 ml无菌离心管中,液
氮速冻,-80℃保存。
大肠杆菌的热激转化
A. 取出感受态细胞置于冰上融化,加入5μL连接产物,在冰上放置15min;
B. 将离心管放置42℃水浴,热击90s后,迅速将离心管转移至冰浴,放置1-2min;
C. 每管加700μL LB(或SOC)液体培养基,于37℃摇床220 rpm温育60min;
D. 4000r/m室温下离心5min,弃上清,菌体用剩余的50μL液体重悬菌体,涂布于含相应抗生素的LB的固体培养基上;
E. 倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜(12-16 h)。
农杆菌感受态细胞制备
(a)从冻存管中挑取农杆菌在YEP培养基(含50mg/L Rif)平皿上划线接种后
过夜培养
(b)挑取单菌落接种于5 ml含50mg/L Rif的YEP液体培养基中,28℃,振
荡培养过夜;
(c)取2m1菌液转入50 ml YEP液体培养基(含50mg/L Rif)中,继续培养至OD值为0.3~0.4;
(d)转入无菌离心管,冰浴30min,4℃,5000 r/min离心10min;
(e)弃上清,用30ml的冰预冷的0.15M NaCl重悬农杆菌沉淀。然后5000r/min,4℃离心10min。
(f)弃上清用2ml的冰预冷的20mM CaCl2重悬农杆菌沉淀。
(g)加入860μl 50%甘油,混匀,每份50μl分装于1.5 ml无菌离心管中,液氮速冻,-80℃保存。