MCP_1_CCR2通路参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区迁移的实验研究

收稿日期：２００７－０９－２６基金项目：新加坡国防部ＤＳＯ基金资助（ＤＳＯ２００３０２０８）作者简介：丁鹏（１９７６－），男，山东淄博人，博士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｄｗｆｍｃ＠１６３．ｃｏｍ；冯忠堂，通讯作者，教授，博士生导师ＭＣＰ－１／ＣＣＲ２通路参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区迁移的实验研究丁鹏１，２，路钢１，２，杨智勇１，王进昆１，余化霖１，薛黎萍３，李园园１，２，冯忠堂２，林荣安４（１．昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明６５００３２；２．昆明医学院生物医学工程研究中心脑研究室，云南昆明６５００３１；３．云南省第二人民医院，云南昆明６５００２１；４．新加坡国立大学解剖系，新加坡１１７５９７）摘要：【目的】探讨单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）及其受体ＣＣＲ２在骨髓基质细胞（ＭＳＣ）体内、外迁移中的作用。

【方法】体外培养、纯化大鼠ＭＳＣ，取第五代ＭＳＣ行免疫荧光鉴定；免疫组化、ＲＴ－ＰＣＲ检测纯化ＭＳＣ表达ＣＣＲ２情况；Ｂｏｙｄｅｎ小室法检测趋化因子ＭＣＰ－１（５～５００ｎｇ／ｍＬ）对ＭＳＣ的趋化迁移作用及其特异性。

４２只成年大鼠用于体内研究（脊髓全横断组２４只，假手术组９只，正常大鼠９只），分别于术后１，３，７，１４ｄ取材，行免疫组化检测ＭＣＰ－１表达，或行ＭＣＰ－１的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定量分析，或颈内静脉注射荧光标记的ＭＳＣ，观察ＭＳＣ向脊髓迁移情况。

【结果】第５代ＭＳＣ都表达间充质干细胞标记物Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｌａｍｉｎｉｎ及Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ；细胞免疫荧光、ＲＴ－ＰＣＲ证实ＭＳＣ表达趋化因子受体ＣＣＲ２；ＭＣＰ－１（５～５００ｎｇ／ｍＬ）体外可趋化ＭＳＣ迁移（Ｐ﹤０．０５），抗ＭＣＰ－１抗体可对抗其趋化迁移作用（Ｐ﹤０．０５）。

脊髓全横断组、对照组脊髓均表达ＭＣＰ－１，但细胞分布、染色存在差异，影响ＭＣＰ－１定量。

脊髓损伤后趋化因子ＭＣＰ－１ＲＮＡ在１ｄ、３ｄ及７ｄ较对正常对照组差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），术后１４ｄ时ＭＣＰ－１ＲＮＡ与正常对照相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），伴随其变化，脊髓损伤区迁移ＭＳＣ较对照差异有统计学意义（Ｐ﹤０．０５）。

【结论】ＭＣＰ－１体内、外可趋化ＭＳＣ迁移，ＭＣＰ－１／ＣＣＲ２通路参与ＭＳＣ向脊髓全横断损伤区的迁移。

关键词：骨髓基质细胞；趋化因子；迁移；脊髓损伤中图分类号：Ｒ３２９．２８文献标识码：Ａ文章编号：１６７２－３５５４（２００８）０２－０１２１－０５ＭＣＰ－１／ＣＣＲ２ＰａｔｈｗａｙＭｅｄｉａｔｅｓＭｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＭａｒｒｏｗＳｔｒｏｍａｌＣｅｌｌｓｉｎｔｏＬｅｓｉｏｎＳｉｔｅｏｆＣｏｍｐｌｅｔｅｌｙＴｒａｎｓｅｃｔｅｄＳｐｉｎａｌＣｏｒｄＤＩＮＧＰｅｎｇ１，２，ＬＵＧａｎｇ１，２，ＹＡＮＧＺｈｉ－ｙｏｎｇ１，ＷＡＮＧＪｉｎ－ｋｕｎ１，ＹＵＨｕａ－ｌｉｎ１，ＸＵＥＬｉ－ｐｉｎｇ３，ＬＩＹｕａｎ－ｙｕａｎ１，２，ＦＥＮＧＺｈｏｎｇ－ｔａｎｇ２，ＬＩＮＧＥｎｇ－ａｎｇ４（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００３２，Ｃｈｉｎａ；２．ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，ＫｕｎｍｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００３１，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎｄＰｅｏｐｌｅ′ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００２１，Ｃｈｉｎａ；４．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎａｔｏｍｙ，ＹｏｎｇＬｏｏＬｉｎＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌ，ＮａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｉｎｇａｐｏｒｅ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ１１７５９７）Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭＣＰ－１）ａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒＣＣＲ２ｉｎｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｏｆｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ（ＭＳＣ）ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＩｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣｆｏｒ５ｐａｓｓａｇｅｓ，ｔｈｅｎｕｓｉｎｇＶｉｍｅｎｔｉｎ，Ｌａｍｉｎｉｎ，ａｎｄＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＭＳＣ．ＵｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＲＴ－ＰＣＲｔｏｄｅｔｅｃｔｗｈｅｔｈｅｒＭＳＣ，ｉｎｖｉｔｒｏ，ｅｘｐｒｅｓｓＣＣＲ２．Ｕｓｉｎｇｃｈｅｍｏｔａｘｉｓａｓｓａｙ（Ｂｏｙｄｅｎｍｅｔｈｏｄ）ｔｏｄｅｔｅｃｔｗｈｅｔｈｅｒＭＣＰ－１（５－５００ｎｇ／ｍＬ）ｅｆｆｅｃｔＭＳＣｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ａｔｏｔａｌｏｆ４２ａｄｕｌｔｒａｔｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｖｉｖｏｓｔｕｄｙ（２４ｒａｔｓｆｏｒｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｔｒａｎｓｅｃｔｅｄｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｍｏｄｅｌｓ，９ｒａｔｓｆｏｒｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎａｎｄ９ｒａｔｓｆｏｒｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ）．Ａｔ１，３，７，ａｎｄ１４ｄａｙｓａｆｔｅｒｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＣＰ－１ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｏｒｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｗａｓｅｘｅｃｕｔｅｄ，ａｎｄｓｏｍｅｒａｔｓｗｅｒｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄＣＦＤＡ－ＳＥｌａｂｅｌｅｄＭＳＣｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｉｎｖｉｖｏ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ａｆｔｅｒ５・基础研究・第２９卷第２期２００８年３月中山大学学报（医学科学版）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＵＮＹＡＴ－ＳＥＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ）Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．２Ｍａｒ．２００８中山大学学报（医学科学版）第２９卷骨髓基质细胞（ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，有多向分化潜能，在体内特定微环境或体外特定培养条件下，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经元及胶质细胞等［１－３］。

目前，ＭＳＣ已被应用治疗脑缺血、脑损伤、脊髓损伤等中枢神经系统疾病，并取得良好的疗效［４－７］。

ＭＳＣ移植治疗中枢神经系统疾病主要有两种方式：一为通过静脉或动脉直接注射ＭＳＣ［４，５］，二为ＭＳＣ损伤区局部注射［６，７］。

Ｃｈｅｎ等报道［４，５］静脉或动脉直接注射ＭＳＣ治疗脑缺血或脑损伤，可引起实验动物功能改善，但目前关于ＭＳＣ向损伤区迁移的具体机制还不清楚。

Ｗａｎｇ等［８，９］报道单核细胞趋化蛋白－１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ－１，ＭＣＰ－１），白细胞介素－８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８，ＩＬ－８）及缺血脑组织提取液体外可诱导ＭＳＣ迁移。

但目前关于脊髓损伤后ＭＣＰ－１的改变情况及静脉注射ＭＳＣ向脊髓损伤区迁移情况未见报道。

本研究拟观察体外培养ＭＳＣ表达趋化因子受体ＣＣＲ２情况，通过体外实验观察趋化因子ＭＣＰ－１对ＭＳＣ的趋化迁移作用，同时观察脊髓损伤后趋化因子ＭＣＰ－１的变化及静脉直接注射ＭＳＣ向脊髓全横断损伤区迁移的情况，以探讨ＭＣＰ－１／ＣＣＲ２通路在ＭＳＣ体内、外迁移中的作用，为研究ＭＳＣ在中枢神经系统疾病中的应用提供理论依据。

１材料和方法１．１材料纯种Ｗｉｓｔａｒ大鼠（新加坡国立大学实验动物中心提供，体外实验２只，体内实验４２只），ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ－ＦａｓｔｓｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＣＦＤＡＳＥＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）。

１．２大鼠ＭＳＣ培养及免疫荧光鉴定按我们文献报道方法体外培养ＭＳＣ［６］，细胞传至第五代分别以羊抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ多克隆抗体（１∶２００，Ｓｉｇｍａ）、兔抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ多克隆抗体（１∶２００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及兔抗Ｌａｍｉｎｉｎ多克隆抗体（１∶２００，Ｓｉｇｍａ）行细胞免疫荧光鉴定。

二抗为Ｃｙ３结合的兔抗羊（１∶２００）及羊抗兔（１：２００）荧光抗体，ＯｌｙｍｐｕｓＦｌｕｏＶｉｅｗＴＭ５００激光共聚焦显微镜观察、拍照。

１．３体外培养ＭＳＣ表达趋化因子受体ＣＣＲ２情况的检测１．３．１细胞免疫荧光检测以兔抗ＣＣＲ２多克隆抗体（１∶１００，Ｔｏｒｒｙｐｉｎｅｓｂｉｏｌａｂｓ）检测体外培养ＭＳＣ趋化因子受体ＣＣＲ２的表达情况，二抗为Ｃｙ３结合的羊抗兔（１∶２００）抗体，ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１荧光显微镜观察、拍照。

１．３．２ＲＴ－ＰＣＲ检测按ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）说明提取ＭＳＣＲＮＡ，分光光度仪上定量及检测ＲＮＡ纯度。

参照ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）说明行ＲＴ－ＰＣＲ，ＣＣＲ２上游引物为：ＣＧＣＡＧＡＧＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＴＧ，下游引物为：ＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡ，序列长度２３３ｂｐ。

ＰＣＲ反应条件如下：９４℃变性１ｍｉｎ，６０℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３６个循环。

ＲＴ－ＰＣＲ产物以２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在ＧＥＮＥＧＥＮＵＳ数码成像及分析系统中观察、拍照。

１．４趋化因子ＭＣＰ－１对ＭＳＣ的体外趋化迁移作用及其特异性检测ｐａｓｓａｇｅｓ，ａｌｌＭＳＣｅｘｐｒｅｓｓＶｉｍｅｎｔｉｎ，Ｌａｍｉｎｉｎ，ａｎｄＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ．ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＲＴ－ＰＣＲｓｈｏｗＭＳＣｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｒＭＣＰ－１ａｎｄＣＣＲ２．ＭＣＰ－１ｉｎｖｉｔｒｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣ（Ｐ﹤０．０５），ａｎｄｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｂｌｏｃｋｅｄｂｙａｎｔｉ－ＭＣＰ－１．ＭＣＰ－１ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ．ＴｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＭＣＰ－１ｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｎｂｏｔｈｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｃｈａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＭＣＰ－１．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＭＣＰ－１ａｔ１，３，ａｎｄ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｏｐｅｒａｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０５）．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ａｔ１４ｄａｙｓｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＣＰ－１ｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｏｎｏｒｍａｌ（Ｐ＞０．０５）．ＩｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄＭＳＣｍｉｇｒａｔｅｔｏｔｈｅｌｅｓｉｏｎｓｉｔｅｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｔｒａｎｓｅｃｔｅｄｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｗｈｅｒｅＭＣＰ－１ｗａｓａｓｓａｙｅｄｔｏｂｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ（Ｐ﹤０．０５）．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＭＣＰ－１／ＣＣＲ２ｐａｔｈｗａｙｍｅｄｉａｔｅｓｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｉｎｔｏｔｈｅｌｅｓｉｏｎｓｉｔｅｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｔｒａｎｓｅｃｔｅｄｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ；ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ［ＪＳＵＮＹａｔ－ｓｅｎＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ），２００８，２９（２）：１２１－１２５，１８０］１２２ＭＳＣ体外趋化实验在４８－孔Ｂｏｙｄｅｎ小室上进行。