抗牛二抗 sigma

华中科技大学硕士学位论文SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究姓名：冯燕申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：杨祥良2011-05-24华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文摘要蛋白质偶联技术是采用一定的技术手段将具有生物活性的蛋白质与其它载体分子或标记物结合在一起的一种方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用。

在标记免疫分析方法中，抗体与酶等标记物的偶联效果会直接影响到免疫方法的灵敏度和可靠性。

常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法、过碘酸钠氧化法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。

在此基础上发展起来的异性双功能偶联剂虽然可以克服这一不足，但酶在抗体上的连接位点具有随机性，导致抗体和酶的活性会受到影响。

因此，在实际应用中，需建立一种能定向偶联的抗体偶联技术。

本研究采用SMCC法，研究优化了免疫球蛋白IgG与辣根过氧化物酶HRP的偶联条件，主要研究内容包括：1) 采用体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，并对其活性进行测定，建立竞争曲线。

2) 从投料比、反应温度、反应时间三个方面对抗体的DTT还原反应过程进行了研究，探讨了还原条件对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。

3) 采用SMCC法将抗体与HRP偶联，并对其活性进行鉴定，并将其用于酶联免疫吸附实验。

研究结果表明，DTT还原反应的温度和时间对抗体结构和活性影响不大，而DTT 的加入量则有明显影响：在封闭巯基的条件下，投料比小于为600时，还原产物以大分子片段居多，当投料比大于600后，产物主要为小分子片段，且抗体活性开始下降，到6000时活性几乎完全丧失；在未封闭巯基条件下，由于游离巯基会重新聚合，当投料比在600～12000之间，抗体活性与产物的组成差异均不明显。

在将其应用于羊抗小鼠二抗与HRP的偶联中，确定优化的SMCC法偶联条件为DTT与抗体华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 投料的比为8000，反应温度为25℃，反应时间在20～30min。

槐耳提取物抗血管新生及抗癌作用的研究王晓龙1、张宁1、霍强1、杨其峰1,31山东大学齐鲁医院乳腺外科，山东济南，250012，摘要中草药，作为有效抗癌药物的一个丰富资源，正广泛地被越来越多的人重视。

最近，槐耳的抗癌功效正被广泛研究。

然而，其药物机理尚不明确。

此课题旨在阐明槐耳提取物对血管新生及癌细胞生长所起的抑制作用。

用槐耳提取物培养，可抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）的增殖。

此外，在体外环境用槐耳提取物处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可以一种剂量依赖的方式降低其侵袭迁移和血管形成的形成。

蛋白质印迹分析所示，槐耳提取物可剂量依赖性减少细胞外调节蛋白激酶(ERK),p65表达，c-Jun氨基端激酶（JNK）, 信号传导与转录激活因子(STAT3), 血管内皮生长因子(VEGF)的水平。

在体内试验中，通过槐耳提取物对鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）和小鼠动脉环处理实验分析，其对血管新生起抑制作用。

为了更好地研究其抑制机理，对BALB/c小鼠皮下注射4T1细胞。

槐耳提取物对抑制肿瘤体积，降低微血管密度，诱导细胞凋亡有一定作用。

这些数据显示，槐耳提取物可以作为一种有效抗血管新生及抗癌抗菌药物。

关键词槐耳，血管新生，癌症，4T1，人脐静脉内皮细胞癌症，是一种多步骤、系统性的疾病。

在2008年，据记载，共有7千6百万人死于癌症（约占总死亡率的13%）。

乳腺癌作为癌症的一种主要类型，在2008年共造成458000人死亡。

在美国，仅2011年便新增230480例浸润型乳腺癌病例，39520人死于乳腺癌。

在发展中国家，乳腺癌患者约占全球总病例的一半，死亡病例约占全球总数的60%,并且在这些地区，乳腺癌是导致妇女患癌死亡的主要因素。

在中国，乳腺癌病例从2002年的126227例猛增到2008年169452例。

然而，目前有效的化学疗法伴随很强的副作用和剂量受限的毒副作用。

因此，能够干预癌症主要发展步骤（如血管新生）的药物正被广泛的用于人类癌症治疗。

不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的比较研究郭 燕 1， 赵凤琴2（1.辽宁医学院，辽宁 锦州 121000；2.辽宁医学院附属第三医院 体检中心，辽宁 锦州 121000）摘要：目的 探讨不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向心肌样细胞分化的影响。

方法 分离培养大鼠MSCs，将第4代经鉴定证实的MSCs随机分成4组：血管紧张素II（AngiotensinII，AngII）诱导组（含不同浓度3个亚组）、心肌细胞裂解液诱导组、AngII+心肌细胞裂解液共同诱导组及空白对照组，并进行定向诱导，观察细胞形态学变化，采用免疫细胞化学法对分化细胞进行鉴定并计算阳性细胞转化率。

结果 除对照组外，其余各组经诱导培养4周后的细胞形态均有改变，且都表达心肌特异性肌钙蛋白I（Cardiac-specific troponin I，cTnI）及间隙连接蛋白43（Connexin-43），但表达率不同，共同诱导组较其余各组形成的克隆、肌管结构多，细胞转化率较高（P<0.05），AngII 单独诱导时以0.2mol/L组诱导效果最佳（P<0.05）。

结论 AngII和心肌细胞裂解液均可将MSCs定向诱导分化为心肌样细胞，二者联合应用转化率更高。

在一定浓度范围内，单独应用AngII诱导，诱导剂浓度越高，转化率越高。

关键词：骨髓间充质干细胞；诱导；心肌样细胞；血管紧张素II；心肌细胞裂解液中图分类号：R 322.11 文献标识码：B心肌梗死（myocardial infarction,MI）后坏死心肌的修复和再生一直是临床医生和科研工作者面临的严峻挑战。

心脏移植因供体来源极其困难、手术技术要求高、费用高昂，在临床难以推广。

随着分子生物学的发展和对干细胞的深入研究，干细胞移植为MI的治疗带来了曙光。

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其取材方便、易于体外扩增、具多重分化的潜能而成为理想种子细胞之一[1]。

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。

方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。

结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。

结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。

【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。

体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。

本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。

本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。

1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。

二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。

小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。